Assoziation von urämischer Sarkopenie und mitochondrialer Kopienzahl und ihren klinischen Korrelaten

Forschungsdesign und -methoden Themen In dieser Studie rekrutieren wir 200 Patienten für die Erhaltungs-Hämodialyse. Zusätzlich fungieren 50 alters- und geschlechtsangepasste Probanden als Kontrollen. Die HD-Patienten befinden sich seit mindestens 3 Monaten unter stabiler Dialyse. Mg 0,75 mmol/L) und durch High-Flux-HD mit synthetischen Membranen (Dialysefilteroberfläche: 1,7 bis 2,1 m2). Alle Huntington-Patienten, die in unsere Studie aufgenommen werden, werden mit DEXA und Handgriffstärke getestet. Demografische Daten werden gesammelt und Laboruntersuchungen werden wie unten aufgeführt durchgeführt.

Biochemische Bestimmungen Blutproben für Laboruntersuchungen wurden am venösen Ende eines Gefäßzugangs zu Beginn der Hämodialysesitzung entnommen und dann bis zum Zeitpunkt der Analyse bei –80°C gelagert. Die Spiegel des hochempfindlichen C-reaktiven Proteins (hsCRP) wurden durch einen kommerziellen immunturbidimetrischen Assay unter Verwendung eines Hitachi-Autoanalysators (Modell 7170) bestimmt. Die Nachweisgrenze und das Intervall für CRP betrug 0,1 mg/l und 0,1–500,0 mg/l. Das Basislinien-Serumalbumin wurde durch das Bromkresolgrün-Verfahren auf einem Hitachi-Autoanalysator (Modell 7170) gemessen. Die Serumspiegel von Cholesterin, Triglycerid und Lipoproteincholesterin niedriger und hoher Dichte wurden durch Standardlaborverfahren bestimmt.

Bestimmung der relativen Leukozyten-mtDNA-Kopienzahl Die Echtzeit-PCR-Reaktion wurde dreifach für jede Reaktion durchgeführt. Die 10-ul-PCR-Reaktion enthält 1X TaqMan Universal PCR Master Mix-Puffer, 500 nM von jedem Primer, 200 nM von TaqMan-Sonde und 0,2-2 ng des gesamten genomischen DNA-Extrakts, PCR-Bedingungen sind 2 min bei 50 ° C, 10 min bei 95 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 15 s Denaturierung bei 95℃ und 60 s Annealing/Extension bei 60℃. Die quantitative Analyse in Echtzeit wurde auf dem StepOne Real-Time PCR-System (ABI) durchgeführt. Die Primer und Sonden für die Echtzeit-PCR sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die PCR-Produkte, an denen Mitochondrien-DNA (MtDNA) und Kern-DNA beteiligt sind.

Standardkurve:

Standard-DNA-Lösungen für das mitochondriale Genom und das Kern-18S-rRNA-Den (nDNA) wurden aus PCR-Produkten erzeugt, die in einen Vektor von pCR2.1-TOPO kloniert wurden. Verdünnungsreihen wurden hergestellt und RT-QPCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um die Standardkurve aus Ct-Werten und der Kopienzahl der Standard-Plasmid-DNA zu konstruieren.

Bestimmung des mtDNA/nDNA-Verhältnisses als Maß für den mtDNA-Gehalt:

Die Kopienzahl der mtDNA und der nDNA wird anhand der Schwellenzykluszahl (Ct) und durch Intrapolation aus der Standardkurve berechnet. Das Verhältnis der Kopienzahl von mtDNA zur Kopienzahl von nDNA ist ein Maß für den mtDNA-Gehalt.[30] Messung des Albumin-Redox-Zustands Die Messung des Albumin-Redox-Zustands wurde unter Verwendung des zuvor berichteten Verfahrens der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt [31]. Das HPLC-Fluoreszenzdetektionssystem (HPLC-FD) bestand aus einem automatischen Probengeber AS-8010 (Injektionsvolumen 2 ml pro Probe; Tosoh, Tokio, Japan) und einem Fluoreszenzdetektor Modell FS-8000 (Anregungswellenlänge 280 nm; Emissionswellenlänge , 340 nm) mit einer CCPM-Doppelkolbenpumpe (Tosoh) in Verbindung mit einem SC-8020-Systemcontroller (Tosoh). Eine Shodex-Asahipak ES-502N 7C-Säule [Showa Denko, Tokyo, Japan; 10 × 0,76 cm (Innendurchmesser), Dimethylaminoethyl-Form für Ionenaustausch-HPLC, Säulentemperatur, 35 °C ± 0,5 °C] oder in einigen Fällen zwei Asahipak GS-520H-Säulen [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japan; 25 × 0,75 cm (Innendurchmesser), gehalten bei 32°C] verwendet. Lineare Gradientenelution wurde mit einem von 0 % auf 5 % ansteigenden Ethanolgehalt in 0,05 M Natriumacetat und 0,40 M Natriumsulfatpuffer (pH 4,85; Acetat-Sulfat-Puffer) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durchgeführt. Die Entlüftung der Pufferlösung wurde durch Einblasen von Helium durchgeführt. Basierend auf den aus diesen Verfahren erhaltenen HPLC-Profilen von HSA wurden die Werte für jede Fraktion einer numerischen Kurvenanpassung unterzogen, und die Fraktionen von HMA, HNA-1 und HNA-2 zu Gesamt-HSA wurden berechnet.

Messungen des Liposaccharid-bindenden Proteins (LBP) Das LBP wurde aus Serumproben und Kontrollen unter Verwendung von standardisierten ELISA-Verfahren (Enzymelinked Immunosorbent Assay) bestimmt, und Serum von normalen Kontrollsubjekten wurde für die Variation zwischen den Assays verwendet.

Gesamtanalyse von 8-iso-PGF2-alpha Die Gesamtkonzentrationen von 8-iso-PGF2-alpha im Plasma wurden mit einem spezifischen Enzymimmunoassay (EIA)-Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich) gemessen. Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände gesammelt, wie zuvor angegeben gereinigt und bis zum Assay bei –80°C gelagert. Die Proben wurden bei 50 &mgr;l nach einer Verdünnung von 1:10 oder 1:20 getestet und bei 420 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät mit 96 Vertiefungen gelesen. Der Assay wurde validiert, um eine hohe Korrelation (0,95) zwischen zugegebenen bekannten Mengen an 8-Isoprostan und der durch EIA gemessenen Konzentration zu erhalten, und wurde direkt durch Gaschromatographie/Massenspektrometrie validiert. Das in diesem Test verwendete Antiserum hat eine 100 %ige Kreuzreaktivität mit 8-iso-PGF2-alpha, jeweils 0,2 % mit PGF2-alpha, PGF3, PGE1, PGE2, jeweils 0,1 % mit 6-Keto-PGF1-alpha. Die Nachweisgrenze des Assays liegt bei 4 pg/ml und der Bereich der Standardkurve lag zwischen 3,9 und 500 pg/ml.

Messungen von Gesamt-p-Kresol und Indoxylsulfat im Serum Plasmakonzentrationen von Gesamt-p-Kresolsulfat (PCS) und Indoxylsulfat (IS) werden mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Kurz gesagt, für die Bindungskonkurrenz wurden 200 μl Serum, zu dem wir 20 μl 0,50 mM 1-Naphthalinsulfonsäure (interner Standard) hinzufügten, mit 250 μl 0,24 M Natriumoctanoat (Bindungskonkurrent) verwirbelt. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur fügten wir 2 ml kalt hinzu Aceton, um Proteine ​​auszufällen. Nach Vortex-Mischen und Zentrifugieren bei 4 °C, 1860 × g für 20 Minuten, wurde der Überstand in 12 mm × 100 mm GL 14 Glasteströhrchen überführt und 2 ml Dichlormethan wurden hinzugefügt. Nach Vortex-Mischen und Zentrifugieren bei 4 °C, 1860 × g für 10 Minuten, wurden 200 μl der oberen Schicht in Autosampler-Glasfläschchen überführt, gefolgt von der Zugabe von 20 μl 1 M HCl und 15 μl wurden auf die HPLC injiziert. Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent LC der Serie 1100 (Santa Clara, CA) durchgeführt, und die Software Agilent ChemStations wurde für die chromatographische Analyse verwendet. Die Trennung wurde auf einer ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC-Säule (5 µm, 3,0 mm x 150 mm) bei einer Flussrate von 0,6 ml/min durchgeführt. Mobile Phase A ist 0,2 % Trifluoressigsäure in Milli-Q-Wasser und mobile Phase B ist 0,2 % Trifluoressigsäure in Acetonitril. Die Analysemethode besteht aus einem isokratischen Lauf mit 92 % mobiler Phase A für 23 min. Auf jeden analytischen Lauf folgte ein 1,3-minütiger Auswaschgradient auf 100 % B. Die Säulentemperatur betrug 25 °C und die Bodentemperatur des automatischen Probengebers 6 °C. Wir quantifizierten die Analyten unter Verwendung des Analyt-zu-Standard-Peakflächenverhältnisses auf einem Agilent 1100 Hochleistungs-Fluoreszenzdetektor G1321A. Die Detektoreinstellungen waren λex 260 nm/λem288 nm für p-Cresylsulfat und λex 280 nm/λem 390 nm für Indoxylsulfat und internen Standard. Quantitative Ergebnisse werden bezogen auf ihre Konzentrationen (mg/l) erhalten und berechnet.

Handgriffstärke Die Muskelstärke wird in der dominanten Hand unter Verwendung eines Jamar-Handdynamometers (Lafayette Instrument Company, USA) bewertet. Die Patienten werden zunächst mit dem Gerät vertraut gemacht und dann im Stehen mit beiden seitlich vom Körper ausgestreckten Armen untersucht, wobei das Dynamometer vom Körper abgewandt ist. Die Patienten wurden angewiesen, das Dynamometer als Reaktion auf einen Sprachbefehl mit der maximalen Kraft zu greifen, und der höchste Wert von drei Messungen wurde für die Studie berücksichtigt. Handgriffstärkewerte (HGS) unterhalb der 30. Perzentile (Tabelle 2) eines alters- und geschlechtsbereinigten bevölkerungsspezifischen Referenzwerts wurden als reduziert angesehen [32].

Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) DEXA ist eine weit verbreitete Referenzmethode für FFM- und FM-Messungen des Körpers.10 DEXA wurde unter Verwendung eines Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI) durchgeführt. Ganzkörperscans wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, und Körper-FM (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) und Knochenmineralgehalt wurden unter Verwendung der Software des Herstellers analysiert. Das DEXA-Verfahren verwendet eine Röntgenröhre mit einem Filter, um Niederenergie (40 kV) zu erzeugen. und hochenergetische (70 oder 100 kV) Photonen. Wenn Photonen mit unterschiedlichen Energieniveaus Gewebe passieren, können ihre Absorptionen als Verhältnis der Dämpfung bei niedrigeren oder höheren Energieniveaus ausgedrückt werden. Die DEXA-Schätzung des FFM wurde als Summe der Schätzungen des LTM- und Knochenmineralgehalts berechnet.

Alle Patienten werden von demselben Beobachter untersucht. Insgesamt empfiehlt AWGS, als Cutoff-Wertbestimmung 2 Standardabweichungen unterhalb der mittleren Muskelmasse der jungen Referenzgruppe bzw. des unteren Quintils zu verwenden. Darüber hinaus empfiehlt AWGS die Verwendung von höhenangepasster Skelettmuskelmasse anstelle von gewichtsangepasster Skelettmuskelmasse, und die vorgeschlagenen Grenzwerte waren 7,0 kg/m2 bei Männern und 5,4 kg/m2 bei Frauen unter Verwendung von DEXA.