Associazione di sarcopenia uremica e numero di copie mitocondriali e relativi correlati clinici

Disegno e metodi della ricerca Soggetti In questo studio, recluteremo 200 pazienti in emodialisi di mantenimento. Inoltre, 50 soggetti abbinati per età e sesso fungono da controlli. I pazienti HD sono in dialisi stabile da almeno 3 mesi I pazienti HD vengono trattati tre volte alla settimana con dialisi standard con bicarbonato (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) e HD ad alto flusso con membrane sintetiche (superficie dei filtri per dialisi: da 1,7 a 2,1 m2). Tutti i pazienti con MH arruolati nel nostro studio saranno testati con DEXA e forza di presa. I dati demografici saranno raccolti e gli esami di laboratorio saranno condotti come elencato di seguito.

Determinazioni biochimiche I campioni di sangue per le analisi di laboratorio sono stati prelevati dall'estremità venosa di un accesso vascolare all'inizio della sessione di emodialisi e quindi conservati a -80°C fino al momento dell'analisi. I livelli di proteina C-reattiva ad alta sensibilità (hsCRP) sono stati determinati mediante un test immunoturbidimetrico commerciale utilizzando un autoanalizzatore Hitachi (modello 7170). Il limite di rilevamento e l'intervallo per CRP erano 0,1 mg/L e 0,1-500,0 mg/L, rispettivamente. L'albumina sierica di base è stata misurata con il metodo del verde di bromocresolo su un autoanalizzatore Hitachi (modello 7170). I livelli sierici di colesterolo, trigliceridi e colesterolo lipoproteico a bassa e alta densità sono stati determinati mediante metodi di laboratorio standard.

Determinazione del numero relativo di copie del mtDNA dei leucociti La reazione PCR in tempo reale è stata eseguita in triplicato per ciascuna reazione. La reazione PCR da 10 ul contiene 1 tampone TaqMan Universal PCR Master Mix, 500 nM di ciascun primer, 200 nM di sonda TaqMan e 0,2-2 ng di estratto totale di DNA genomico, le condizioni di PCR sono 2 min a 50 ℃, 10 min a 95 ℃, seguite da 40 cicli di 15 s di denaturazione a 95℃ e 60 s di ricottura/estensione a 60℃. L'analisi quantitativa in tempo reale è stata eseguita sul sistema StepOne Real-Time PCR (ABI). I primer e le sonde per la PCR in tempo reale sono elencati nella Tabella 1. I prodotti della PCR che coinvolgono il DNA mitocondriale (MtDNA) e il DNA nucleare.

Curva standard:

Le soluzioni di DNA standard per il genoma mitocondriale e il dene nucleare 18S rRNA (nDNA) sono state generate da prodotti PCR clonati in un vettore di pCR2.1-TOPO. Sono state effettuate diluizioni seriali e sono state eseguite reazioni RT-QPCR per costruire la curva standard dai valori Ct e dal numero di copie del DNA plasmidico standard.

Determinazione del rapporto mtDNA/nDNA come misura del contenuto di mtDNA:

Il numero di copie del mtDNA e del nDNA viene calcolato utilizzando il numero di ciclo di soglia (Ct) e intrapolando dalla curva standard. Il rapporto tra il numero di copie di mtDNA e il numero di copie di nDNA è la misurazione del contenuto di mtDNA.[30] Misurazione dello stato redox dell'albumina La misurazione dello stato redox dell'albumina è stata eseguita utilizzando il metodo della cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) riportato in precedenza [31]. Il sistema di rilevamento della fluorescenza HPLC (HPLC-FD) consisteva in un campionatore automatico AS-8010 (volume di iniezione, 2 mL per campione; Tosoh, Tokyo, Giappone) e un rilevatore di fluorescenza modello FS-8000 (lunghezza d'onda di eccitazione, 280 nm; lunghezza d'onda di emissione , 340 nm) con una pompa a doppio stantuffo CCPM (Tosoh) in combinazione con un controller di sistema SC-8020 (Tosoh). Una colonna Shodex-Asahipak ES-502N 7C [Showa Denko, Tokyo, Giappone; 10×0,76 cm (diametro interno), forma dimetilamminoetile per HPLC a scambio ionico, temperatura colonna, 35°C±0,5°C] o in alcuni casi due colonne Asahipak GS-520H [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Giappone; 25×0,75 cm (diametro interno) mantenuto a 32°C]. L'eluizione a gradiente lineare è stata eseguita con un livello di etanolo crescente dallo 0% al 5% in tampone di acetato di sodio 0,05 M e tampone di solfato di sodio 0,40 M (pH 4,85; tampone acetato-solfato) a una velocità di flusso di 1,0 mL/min. La disaerazione della soluzione tampone è stata eseguita mediante gorgogliamento di elio. Sulla base dei profili HPLC di HSA ottenuti da queste procedure, i valori per ciascuna frazione sono stati sottoposti all'adattamento della curva numerica e sono state calcolate le frazioni di HMA, HNA-1 e HNA-2 rispetto all'HSA totale.

Misurazioni della proteina legante i liposaccaridi (LBP) L'LBP è stato determinato da campioni di siero e controlli utilizzando metodi standardizzati ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) e il siero di soggetti di controllo normali è stato utilizzato per la variazione interdosaggio.

Totale di 8-iso-PGF2-alfa Analisi Le concentrazioni totali di 8-iso-PGF2-alfa nel plasma sono state misurate mediante uno specifico kit di dosaggio immunoenzimatico (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). I campioni sono stati centrifugati e i surnatanti sono stati raccolti, purificati come indicato in precedenza e conservati a -80°C fino all'analisi. I campioni sono stati analizzati a 50 μl dopo una diluizione 1:10 o 1:20 e letti a 420 nm in un lettore di micropiastre a 96 pozzetti. Il test è stato convalidato per ottenere un'elevata correlazione (0,95) tra le quantità note aggiunte di 8-isoprostano e la concentrazione misurata mediante EIA ed è stato convalidato direttamente mediante gascromatografia/spettrometria di massa. L'antisiero utilizzato in questo test ha una reattività crociata del 100% con 8-iso-PGF2-alfa 0,2% ciascuno con PGF2-alfa, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1% ciascuno con 6-cheto-PGF1-alfa. Il limite di rilevamento del saggio è di 4 pg/ml e l'intervallo della curva standard era compreso tra 3,9 e 500 pg/ml.

Misurazioni del p-cresolo sierico totale e del solfato di indossile Le concentrazioni plasmatiche del p-cresolo solfato totale (PCS) e del solfato di indossile (IS) vengono analizzate con la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). In breve, per la competizione legante, 200 μl di siero a cui abbiamo aggiunto 20 μl 0,50 mM di acido 1-naftalensolfonico (standard interno) è stato miscelato su vortex con 250 μl 0,24 M di ottanoato di sodio (concorrente legante). Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti, abbiamo aggiunto 2 ml di freddo acetone per precipitare le proteine. Dopo la miscelazione su vortex e la centrifugazione a 4 °C, 1860 × g per 20 minuti, il surnatante è stato trasferito in provette di vetro GL 14 da 12 mm × 100 mm e sono stati aggiunti 2 ml di diclorometano. Dopo la miscelazione su vortex e la centrifugazione a 4 ◦C, 1860 × g per 10 minuti, 200 μl dello strato superiore sono stati trasferiti in fiale di autocampionatore di vetro, seguiti dall'aggiunta di 20 μl 1M HCl e 15 μl sono stati iniettati sull'HPLC. L'analisi HPLC è stata eseguita su un LC Agilent serie 1100 (Santa Clara, CA) e per l'analisi cromatografica è stato utilizzato il software Agilent ChemStations. La separazione è stata effettuata su una colonna HPLC ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus (5 μm, 3,0 mm×150 mm) a una portata di 0,6 ml/min. La fase mobile A è allo 0,2% di acido trifluoroacetico in acqua Milli-Q e la fase mobile B è allo 0,2% di acido trifluoroacetico in acetonitrile. Il metodo analitico consiste in una corsa isocratica con il 92% di fase mobile A per 23 min.. Ciascun ciclo analitico è stato seguito da un gradiente di lavaggio di 1,3 minuti al 100% B. La temperatura della colonna era di 25 °C e la temperatura del vassoio del campionatore automatico era di 6 °C. Abbiamo quantificato gli analiti utilizzando il rapporto tra analita e area di picco standard su un rivelatore di fluorescenza ad alte prestazioni Agilent 1100 G1321A. Le impostazioni del rivelatore erano λex 260 nm/λem288nm per p-cresil solfato e λex 280 nm/λem 390nm per indossil solfato e standard interno. I risultati quantitativi sono ottenuti e calcolati in termini di loro concentrazioni (mg/L).

Forza di presa La forza muscolare viene valutata nella mano dominante utilizzando un dinamometro a mano Jamar (Lafayette Instrument Company, USA). I pazienti vengono dapprima familiarizzati con il dispositivo e sono stati quindi esaminati in piedi con entrambe le braccia estese lateralmente rispetto al corpo con il dinamometro rivolto lontano dal corpo. Ai pazienti è stato chiesto di afferrare il dinamometro con la massima forza in risposta a un comando vocale e per lo studio è stato considerato il valore più alto di tre misurazioni. I valori di forza di presa (HGS) al di sotto del 30° percentile (Tabella 2) da un valore di riferimento per una popolazione specifica aggiustato per età e sesso sono stati considerati ridotti [32].

Assorbimetria a raggi X a doppia energia (DEXA) DEXA è un metodo di riferimento ampiamente utilizzato per le misurazioni FFM e FM del corpo.10 La DEXA è stata eseguita utilizzando un Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Le scansioni di tutto il corpo sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore e il contenuto di FM del corpo (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) e minerale osseo viene analizzato utilizzando il software del produttore. Il metodo DEXA utilizza un tubo a raggi X con un filtro per generare bassa energia (40 kV). e fotoni ad alta energia (70 o 100 kV). Quando i fotoni a diversi livelli di energia passano attraverso il tessuto, i loro assorbimenti possono essere espressi come rapporto di attenuazione a livelli di energia inferiori o superiori. La stima DEXA di FFM è stata calcolata come somma di LTM e stime del contenuto minerale osseo.

Tutti i pazienti saranno esaminati dallo stesso osservatore. Complessivamente, AWGS raccomanda di utilizzare 2 deviazioni standard al di sotto della massa muscolare media del gruppo di riferimento giovane o del quintile inferiore come determinazione del valore limite. Inoltre, AWGS raccomanda di utilizzare la massa muscolare scheletrica regolata in base all'altezza invece della massa muscolare scheletrica regolata in base al peso e i valori limite suggeriti erano 7,0 kg/m2 negli uomini e 5,4 kg/m2 nelle donne utilizzando DEXA.