Association of Uremic Sarcopenia and Mitochondrial Copy Number and Its Clinical Correlates

Forskningsdesign og metoder Forsøkspersoner I denne studien skal vi rekruttere 200 pasienter på vedlikeholdshemodialyse. I tillegg fungerer 50 alders- og kjønnsmatchede forsøkspersoner som kontroller. HD-pasientene har vært i stabil dialyse i minst 3 måneder. HD-pasienter behandles tre ganger ukentlig med standard bikarbonatdialyse (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) og ved høyflux HD med syntetiske membraner (dialysefiltre overflateareal: 1,7 til 2,1 m2). Alle HD-pasienter som deltar i vår studie vil bli testet med DEXA og håndgrepsstyrke. Demografiske data vil bli samlet inn og laboratorieundersøkelser utføres som oppført nedenfor.

Biokjemiske bestemmelser Blodprøver for laboratorietesting ble tatt fra den venøse enden av en vaskulær tilgang ved begynnelsen av hemodialysesesjonen og deretter lagret ved -80°C frem til analysetidspunktet. De høysensitive C-reaktive proteinnivåene (hsCRP) ble bestemt ved en kommersiell immunoturbidimetrisk analyse ved bruk av en Hitachi autoanalyzer (modell 7170). Deteksjonsgrensen og intervallet for CRP var 0,1 mg/L og 0,1-500,0 mg/L, henholdsvis. Baseline serumalbumin ble målt ved bromocresol green-metoden på en Hitachi autoanalyzer (modell 7170). Serumnivåer av kolesterol, triglyserid og lipoproteinkolesterol med lav og høy tetthet ble bestemt ved standard laboratoriemetoder.

Bestemmelse av relativ leukocytt-mtDNA-kopinummer. Sanntids-PCR-reaksjonen ble utført i tre eksemplarer for hver reaksjon. 10 ul PCR-reaksjonen inneholder 1X TaqMan Universal PCR Master Mix-buffer, 500 nM av hver primer, 200 nM TaqMan-probe og 0,2-2 ng av totalt genomisk DNA-ekstrakt, PCR-betingelser er 2 minutter ved 50 ℃, 10 min ved 95 ℃, etterfulgt av 40 sykluser med 15 s denaturering ved 95 ℃ og 60 s annealing/forlengelse ved 60 ℃. Kvantitativ sanntidsanalyse ble utført på StepOne Real-Time PCR-system (ABI). Primerne og probene for sanntids PCR er oppført i tabell 1. PCR-produktene som involverer mitokondrier-DNA (MtDNA) og kjernefysisk DNA.

Standard kurve:

Standard DNA-løsninger for mitokondrie-genomet og det nukleære 18S rRNA-dene (nDNA) ble generert fra PCR-produkter klonet i en vektor av pCR2.1-TOPO. Seriefortynninger ble laget og RT-QPCR-reaksjoner ble utført for å konstruere standardkurven fra Ct-verdier og antall kopier av standard plasmid-DNA.

Bestemmelse av mtDNA/nDNA-forhold som et mål på mtDNA-innhold:

Kopinummeret til mtDNA og nDNA beregnes ved å bruke terskelsyklusnummeret (Ct) og intrapoleres fra standardkurven. Forholdet mellom kopiantallet av mtDNA og kopiantallet av nDNA er måling av mtDNA-innholdet.[30] Måling av albuminredokstilstanden Måling av albuminredokstilstanden ble utført ved bruk av høyytelses væskekromatografi (HPLC)-metoden rapportert tidligere [31]. HPLC-fluorescensdeteksjonssystemet (HPLC-FD) besto av en AS-8010 autosampler (injeksjonsvolum, 2 mL per prøve; Tosoh, Tokyo, Japan) og en modell FS-8000 fluorescensdetektor (eksitasjonsbølgelengde, 280 nm; emisjonsbølgelengde , 340 nm) med en CCPM dobbeltstempelpumpe (Tosoh) i forbindelse med en SC-8020 systemkontroller (Tosoh). En Shodex-Asahipak ES-502N 7C kolonne [Showa Denko, Tokyo, Japan; 10×0,76 cm (indre diameter), dimetylaminoetyl-form for ionebytter-HPLC, kolonnetemperatur, 35°C±0,5°C] eller i noen tilfeller to Asahipak GS-520H kolonner [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japan; 25 x 0,75 cm (indre diameter) holdt ved 32°C] ble brukt. Lineær gradienteluering ble utført med et etanolnivå økende fra 0 % til 5 % i 0,05 M natriumacetat og 0,40 M natriumsulfatbuffer (pH 4,85; acetat-sulfatbuffer) ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min. Avlufting av bufferløsningen ble utført ved heliumbobling. Basert på HPLC-profilene til HSA oppnådd fra disse prosedyrene, ble verdiene for hver fraksjon utsatt for numerisk kurvetilpasning, og fraksjonene av HMA, HNA-1 og HNA-2 til total HSA ble beregnet.

Målinger av liposakkarid-bindende protein (LBP) LBP ble bestemt fra serumprøver og kontroller ved bruk av standardiserte enzymbundne immunosorbentanalysemetoder (ELISA), og serum fra normale kontrollpersoner ble brukt for interassayvariasjon.

Totalt 8-iso-PGF2-alfa-analyse Totale 8-iso-PGF2-alfa-konsentrasjoner i plasma ble målt med et spesifikt enzymimmunoassay (EIA)-sett (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). Prøver ble sentrifugert og supernatantene ble samlet, renset som angitt tidligere og lagret ved -80°C inntil de ble analysert. Prøver ble analysert ved 50 μl etter en 1:10 eller 1:20 fortynning og avlest ved 420 nm i en 96-brønners mikroplateleser. Analysen er validert for å oppnå en høy korrelasjon (0,95) mellom tilsatte kjente mengder 8-isoprostan og konsentrasjonen målt ved EIA og er direkte validert ved gasskromatografi/massespektrometri. Antiserumet brukt i denne analysen har en 100 % kryssreaktivitet med 8-iso-PGF2-alfa 0,2 % hver med PGF2-alfa, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1 % hver med 6-keto-PGF1-alfa. Deteksjonsgrensen for analysen er 4 pg/ml og standardkurveområdet var fra 3,9 til 500 pg/ml.

Målinger av totalt p-kresol og indoksylsulfat i serum Plasmakonsentrasjoner av totalt p-kresolsulfat (PCS) og indoksylsulfat (IS) analyseres med høyytelses væskekromatografi (HPLC). Kort fortalt, for bindingskonkurranse, ble 200 μl serum som vi tilsatte 20 μl 0,50 mM 1-naftalensulfonsyre (intern standard) virvelblandet med 250 μl 0,24 M natriumoktanoat (bindingskonkurrent). Etter inkubasjon ved romtemperatur tilsatte vi 25 mlmin. aceton for å felle ut proteiner. Etter virvelblanding og sentrifugering ved 4 ◦C, 1860×g i 20 minutter, ble supernatanten overført til 12 mm×100 mm, GL 14 glassreagensrør og 2 ml diklormetan ble tilsatt. Etter vortex-blanding og sentrifugering ved 4 ◦C, 1860×g i 10 minutter, ble 200μl av det øvre laget overført til autosampler-ampuller av glass, etterfulgt av tilsetning av 20μl 1M HCl og 15μl ble injisert på HPLC. HPLC-analysen ble utført på en Agilent 1100-serie LC (Santa Clara, CA), og Agilent ChemStations-programvare ble brukt for den kromatografiske analysen. Separasjonen ble utført på en ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC-kolonne (5 μm, 3,0 mm×150 mm) med en strømningshastighet på 0,6 ml/min. Mobil fase A er 0,2 % trifluoreddiksyre i Milli-Q vann og mobil fase B er 0,2 % trifluoreddiksyre i acetonitril. Analysemetoden består av en isokratisk kjøring med 92 % mobil fase A i 23 minutter. Hver analytisk kjøring ble etterfulgt av en 1,3 min utvaskingsgradient til 100 % B. Kolonnetemperaturen var 25 ◦C, og temperaturen på autosampler-brettet var 6 ◦C. Vi kvantifiserte analyttene ved å bruke analytten til standard topparealforhold på en Agilent 1100 High Performance Fluorescence-detektor G1321A. Detektorinnstillinger var λex 260 nm/λem288nm for p-kresylsulfat og λex 280 nm/λem 390nm for indoksylsulfat og intern standard. Kvantitative resultater oppnås og beregnes i form av deres konsentrasjoner (mg/L).

Håndtaksstyrke Muskelstyrken vurderes i den dominerende hånden ved hjelp av et Jamar hånddynamometer (Lafayette Instrument Company, USA). Pasientene blir først kjent med enheten og ble deretter undersøkt stående med begge armene strukket sidelengs fra kroppen med dynamometeret vendt bort fra kroppen. Pasientene ble bedt om å gripe dynamometeret med maksimal styrke som svar på en talekommando, og den høyeste verdien av tre målinger ble vurdert for studien. Håndgrepsstyrke (HGS) verdier under 30. persentilen (tabell 2) fra en spesifikk populasjonsreferanseverdi justert for alder og kjønn ble ansett som redusert [32].

Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) DEXA er en mye brukt referansemetode for kropps-FFM- og FM-målinger.10 DEXA ble utført ved bruk av en Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Helkroppsskanninger ble utført i henhold til produsentens instruksjoner, og kroppens FM (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) og benmineralinnhold analyseres ved hjelp av produsentens programvare. DEXA-metoden bruker et røntgenrør med filter for å generere lavenergi (40 kV). og høyenergi (70 eller 100 kV) fotoner. Når fotonsat forskjellige energinivåer passerer gjennom vev, kan deres absorpsjoner uttrykkes som et forhold mellom demping ved lavere eller høyere energinivåer. DEXA estimat av FFM ble beregnet som en sum av LTM og benmineralinnhold estimater.

Alle pasienter vil bli undersøkt av samme observatør. Totalt sett anbefaler AWGS å bruke 2 standardavvik under gjennomsnittlig muskelmasse for unge referansegrupper eller den nedre kvintilen som grenseverdibestemmelse. Dessuten anbefaler AWGS å bruke høydejustert skjelettmuskelmasse i stedet for vektjustert skjelettmuskelmasse, og de foreslåtte grenseverdiene var 7,0 kg/m2 hos menn og 5,4 kg/m2 hos kvinner ved bruk av DEXA.