Asociace uremické sarkopenie a počtu mitochondriálních kopií a její klinické koreláty

Návrh a metody výzkumu Subjekty V této studii zařadíme 200 pacientů na udržovací hemodialýzu. Kromě toho 50 subjektů stejného věku a pohlaví působí jako kontroly. HD pacienti jsou na stabilní dialýze po dobu minimálně 3 měsíců HD pacienti jsou léčeni třikrát týdně standardní bikarbonátovou dialýzou (Na 138 mmol/l, HCO3 35 mmol/l, K 1,5 mmol/l, Ca 1,25 mmol/l, Mg 0,75 mmol/l) a vysokoprůtokovou HD se syntetickými membránami (plocha dialyzačních filtrů: 1,7 až 2,1 m2). Všichni HD pacienti zařazení do naší studie budou testováni pomocí DEXA a síly rukojeti. Budou shromažďovány demografické údaje a prováděna laboratorní vyšetření, jak je uvedeno níže.

Biochemická stanovení Vzorky krve pro laboratorní testování byly odebrány z venózního konce cévního vstupu na začátku hemodialýzy a poté uchovávány při -80 °C až do doby analýzy. Hladiny vysoce citlivého C-reaktivního proteinu (hsCRP) byly stanoveny komerčním imunoturbidimetrickým testem za použití autoanalyzátoru Hitachi (model 7170). Detekční limit a interval pro CRP byl 0,1 mg/l a 0,1-500,0 mg/l, resp. Základní hladina sérového albuminu byla měřena metodou bromokresolové zeleně na autoanalyzátoru Hitachi (model 7170). Sérové ​​hladiny cholesterolu, triglyceridů a cholesterolu s nízkou a vysokou hustotou lipoproteinů byly stanoveny standardními laboratorními metodami.

Stanovení relativního počtu kopií mtDNA leukocytů Reakce PCR v reálném čase byla provedena třikrát pro každou reakci. 10 ul PCR reakce obsahuje 1X TaqMan Universal PCR Master Mix pufr, 500 nM každého primeru, 200 nM TaqMan sondy a 0,2-2 ng extraktu celkové genomové DNA, podmínky PCR jsou 2 minuty při 50 °C, 10 minut při 95 °C, následuje 40 cyklů 15s denaturace při 95℃ a 60s žíhání/prodlužování při 60℃. Kvantitativní analýza v reálném čase byla provedena na systému StepOne Real-Time PCR (ABI). Primery a sondy pro PCR v reálném čase jsou uvedeny v tabulce 1. Produkty PCR, které zahrnují mitochondriální DNA (MtDNA) a jadernou DNA.

Standardní křivka:

Standardní roztoky DNA pro mitochondriální genom a nukleární 18S rRNA den (nDNA) byly vytvořeny z PCR produktů klonovaných ve vektoru pCR2.1-TOPO. Byla provedena sériová ředění a byly provedeny reakce RT-QPCR pro sestrojení standardní křivky z hodnot Ct a počtu kopií standardní plazmidové DNA.

Stanovení poměru mtDNA/nDNA jako míra obsahu mtDNA:

Počet kopií mtDNA a nDNA se vypočítá pomocí prahového počtu cyklu (Ct) a intrapolací ze standardní křivky. Poměr počtu kopií mtDNA k počtu kopií nDNA je měřením obsahu mtDNA.[30] Měření redoxního stavu albuminu Měření redoxního stavu albuminu bylo provedeno pomocí metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), která byla popsána dříve [31]. Systém HPLC-fluorescenční detekce (HPLC-FD) sestával z automatického vzorkovače AS-8010 (objem nástřiku, 2 ml na vzorek; Tosoh, Tokio, Japonsko) a fluorescenčního detektoru Model FS-8000 (vlnová délka excitace, 280 nm; vlnová délka emise , 340 nm) s dvojitým pístovým čerpadlem CCPM (Tosoh) ve spojení se systémovým ovladačem SC-8020 (Tosoh). Kolona Shodex-Asahipak ES-502N 7C [Showa Denko, Tokio, Japonsko; 10×0,76 cm (vnitřní průměr), dimethylaminoethyl-forma pro iontoměničovou HPLC, teplota kolony, 35 °C ± 0,5 °C] nebo v některých případech dvě kolony Asahipak GS-520H [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japonsko; 25 x 0,75 cm (vnitřní průměr) udržované na 32 °C]. Lineární gradientová eluce byla prováděna s hladinou ethanolu zvyšující se z 0 % na 5 % v 0,05 M octanu sodném a 0,40 M pufru síranu sodného (pH 4,85; acetát-sulfátový pufr) při průtoku 1,0 ml/min. Odvzdušnění tlumivého roztoku bylo provedeno probubláváním heliem. Na základě HPLC profilů HSA získaných z těchto postupů byly hodnoty pro každou frakci podrobeny proložení numerické křivky a byly vypočteny frakce HMA, HNA-1 a HNA-2 k celkovému HSA.

Měření proteinu vázajícího liposacharidy (LBP) LBP byl stanoven ze vzorků séra a kontrol za použití standardizovaných metod ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) a pro variaci mezi testy bylo použito sérum od normálních kontrolních subjektů.

Celková analýza 8-iso-PGF2-alfa Celkové koncentrace 8-iso-PGF2-alfa v plazmě byly měřeny pomocí specifické enzymové imunoanalýzy (EIA) kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan). Vzorky byly odstředěny a supernatanty byly shromážděny, purifikovány, jak bylo uvedeno dříve a skladovány při -80 °C až do testování. Vzorky byly testovány při 50 ul po ředění 1:10 nebo 1:20 a odečteny při 420 nm v 96jamkové čtečce mikrodestiček. Test byl validován pro získání vysoké korelace (0,95) mezi přidanými známými množstvími 8-isoprostanu a koncentrací měřenou pomocí EIA a byl přímo validován plynovou chromatografií/hmotnostní spektrometrií. Antisérum použité v tomto testu má 100% zkříženou reaktivitu s 8-iso-PGF2-alfa 0,2 % každý s PGF2-alfa, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1 % každý s 6-keto-PGF1-alfa. Detekční limit testu je 4 pg/ml a rozsah standardní křivky byl od 3,9 do 500 pg/ml.

Měření celkového p-kresolu a indoxylsulfátu v séru Plazmatické koncentrace celkového p-kresolsulfátu (PCS) a indoxylsulfátu (IS) jsou analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Stručně řečeno, pro vazebnou soutěž bylo 200 μl séra, do kterého jsme přidali 20 μl 0,50 mM kyseliny 1-naftalensulfonové (vnitřní standard) promícháno na vortexu s 250 μl 0,24 M oktanoátu sodného (vazebný kompetitor). Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 5 minut jsme přidali 2 ml chladu aceton k vysrážení bílkovin. Po vortexovém míchání a centrifugaci při 4 °C, 1860 x g po dobu 20 minut byl supernatant přenesen do skleněných zkumavek GL 14 o rozměrech 12 mm x 100 mm a byly přidány 2 ml dichlormethanu. Po vortexovém promíchání a odstředění při 4 °C, 1860×g po dobu 10 minut bylo 200 μl horní vrstvy přeneseno do skleněných lahviček autosampleru, poté bylo přidáno 20 μl 1M HCl a 15 μl bylo nastříknuto na HPLC. HPLC analýza byla provedena na Agilent 1100 series LC (Santa Clara, CA) a pro chromatografickou analýzu byl použit software Agilent ChemStations. Separace byla provedena na koloně ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC (5 um, 3,0 mm x 150 mm) při průtoku 0,6 ml/min. Mobilní fáze A je 0,2% kyselina trifluoroctová v Milli-Q vodě a mobilní fáze B je 0,2% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu. Analytická metoda sestává z izokratického běhu s 92% mobilní fází A po dobu 23 minut. Po každém analytickém běhu následoval 1,3 min vymývací gradient na 100 % B. Teplota kolony byla 25 °C a teplota tácu autosampleru byla 6 °C. Analyty jsme kvantifikovali pomocí poměru plochy analytu ke standardnímu píku na Agilent 1100 High Performance Fluorescence Detector G1321A. Nastavení detektoru bylo λex 260 nm/λem288nm pro p-kresylsulfát a λex 280 nm/λem 390nm pro indoxylsulfát a vnitřní standard. Kvantitativní výsledky jsou získány a vypočteny z hlediska jejich koncentrací (mg/l).

Síla stisku Svalová síla se hodnotí v dominantní ruce pomocí ručního dynamometru Jamar (Lafayette Instrument Company, USA). Pacienti jsou nejprve seznámeni s přístrojem a poté byli vyšetřeni ve stoje s oběma pažemi nataženými bokem od těla s dynamometrem směrem od těla. Pacienti byli instruováni, aby uchopili dynamometr maximální silou v reakci na hlasový příkaz a pro studii byla uvažována nejvyšší hodnota ze tří měření. Hodnoty síly stisku ruky (HGS) pod 30. percentilem (tabulka 2) z referenční hodnoty specifické populace upravené podle věku a pohlaví byly považovány za snížené [32].

Dual-Energy X-ray Absorptiometrie (DEXA) DEXA je široce používaná referenční metoda pro měření tělesného FFM a FM.10 DEXA byla provedena pomocí Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Skenování celého těla bylo provedeno podle pokynů výrobce a tělesný FM (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) a obsah kostních minerálů byly analyzovány pomocí softwaru výrobce. Metoda DEXA využívá rentgenku s filtrem pro generování nízkoenergetické (40 kV). a vysokoenergetické (70 nebo 100 kV) fotony. Když různé energetické hladiny fotonů procházejí tkání, jejich absorpce lze vyjádřit jako poměr zeslabení při nižších nebo vyšších energetických hladinách. DEXA odhad FFM byl vypočten jako součet LTM a odhadů obsahu kostních minerálů.

Všichni pacienti budou vyšetřeni stejným pozorovatelem. Celkově AWGS doporučuje jako hraniční hodnotu použít 2 standardní odchylky pod průměrnou svalovou hmotou mladé referenční skupiny nebo dolní kvintil. Kromě toho AWGS doporučuje používat hmotu kosterního svalstva s upravenou výškou místo hmoty kosterního svalstva s upravenou hmotností a navrhované mezní hodnoty byly 7,0 kg/m2 u mužů a 5,4 kg/m2 u žen při použití DEXA.