Sammenslutningen af ​​uræmisk sarkopeni og mitokondriel kopinummer og dets kliniske korrelater

Forskningsdesign og -metoder Emner I denne undersøgelse skal vi rekruttere 200 patienter i vedligeholdelseshæmodialyse. Derudover fungerer 50 alders- og kønsmatchede forsøgspersoner som kontroller. HD-patienterne har været i stabil dialyse i mindst 3 måneder. HD-patienterne behandles tre gange ugentligt med standard bicarbonatdialyse (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) og ved højflux HD med syntetiske membraner (dialysefiltre overfladeareal: 1,7 til 2,1 m2). Alle HD-patienter, der deltager i vores undersøgelse, vil blive testet med DEXA og håndgrebsstyrke. Demografiske data vil blive indsamlet, og laboratorieundersøgelser udføres som anført nedenfor.

Biokemiske bestemmelser Blodprøver til laboratorietestning blev udtaget fra den venøse ende af en vaskulær adgang ved begyndelsen af ​​hæmodialysesessionen og derefter opbevaret ved -80°C indtil analysetidspunktet. De højfølsomme C-reaktive protein (hsCRP) niveauer blev bestemt ved et kommercielt immunoturbidimetrisk assay under anvendelse af en Hitachi autoanalyzer (model 7170). Detektionsgrænsen og intervallet for CRP var 0,1 mg/L og 0,1-500,0 mg/L hhv. Baseline serumalbumin blev målt ved bromocresol green-metoden på en Hitachi autoanalyzer (model 7170). Serumniveauer af kolesterol, triglycerid og lav- og højdensitetslipoproteinkolesterol blev bestemt ved standard laboratoriemetoder.

Bestemmelse af relativ leukocyt-mtDNA-kopital. Real-time PCR-reaktionen blev udført i tre eksemplarer for hver reaktion. 10 ul PCR-reaktionen indeholder 1X TaqMan Universal PCR Master Mix-buffer, 500 nM af hver primer, 200 nM TaqMan-probe og 0,2-2 ng totalt genomisk DNA-ekstrakt, PCR-betingelser er 2 min ved 50 ℃, 10 min ved 95 ℃, efterfulgt af 40 cyklusser af 15 s denaturering ved 95 ℃ og 60 s annealing/forlængelse ved 60 ℃. Kvantitativ realtidsanalyse blev udført på StepOne Real-Time PCR-system (ABI). Primerne og proberne til real-time PCR er anført i tabel 1. PCR-produkterne, der involverer mitokondrier-DNA (MtDNA) og nuklear DNA.

Standardkurve:

Standard-DNA-opløsninger til mitokondriegenomet og det nukleare 18S rRNA-dene (nDNA) blev genereret fra PCR-produkter klonet i en vektor af pCR2.1-TOPO. Seriefortyndinger blev lavet, og RT-QPCR-reaktioner blev udført for at konstruere standardkurven ud fra Ct-værdier og antallet af kopier af standardplasmid-DNA'et.

Bestemmelse af mtDNA/nDNA-forhold som et mål for mtDNA-indhold:

Kopitallet for mtDNA'et og nDNA'et beregnes ved hjælp af tærskelcyklusnummeret (Ct) og intrapolering fra standardkurven. Forholdet mellem kopiantallet af mtDNA og kopiantallet af nDNA er måling af mtDNA-indholdet.[30] Måling af albumin-redox-tilstanden. Måling af albumin-redox-tilstanden blev udført ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC)-metoden rapporteret tidligere [31]. HPLC-fluorescensdetektionssystemet (HPLC-FD) bestod af en AS-8010 autosampler (injektionsvolumen, 2 mL pr. prøve; Tosoh, Tokyo, Japan) og en Model FS-8000 fluorescensdetektor (excitationsbølgelængde, 280 nm; emissionsbølgelængde , 340 nm) med en CCPM dobbeltstempelpumpe (Tosoh) i forbindelse med en SC-8020 systemcontroller (Tosoh). En Shodex-Asahipak ES-502N 7C søjle [Showa Denko, Tokyo, Japan; 10×0,76 cm (indre diameter), dimethylaminoethyl-form til ionbytnings-HPLC, søjletemperatur, 35°C±0,5°C] eller i nogle tilfælde to Asahipak GS-520H kolonner [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japan; 25 x 0,75 cm (indre diameter) holdt ved 32°C] blev anvendt. Lineær gradienteluering blev udført med et ethanolniveau, der steg fra 0 % til 5 % i 0,05 M natriumacetat og 0,40 M natriumsulfatbuffer (pH 4,85; acetat-sulfatbuffer) ved en strømningshastighed på 1,0 ml/min. Afluftning af bufferopløsningen blev udført ved heliumbobling. Baseret på HPLC-profilerne for HSA opnået fra disse procedurer blev værdierne for hver fraktion underkastet numerisk kurvetilpasning, og fraktionerne af HMA, HNA-1 og HNA-2 til total HSA blev beregnet.

Målinger af liposaccharid-bindende protein (LBP) LBP blev bestemt ud fra serumprøver og kontroller under anvendelse af standardiserede enzymbundne immunosorbent assay (ELISA) metoder, og serum fra normale kontrolpersoner blev brugt til interassay variation.

Total af 8-iso-PGF2-alfa-analyse Totale 8-iso-PGF2-alfa-koncentrationer i plasma blev målt med et specifikt enzymimmunoassay (EIA) kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). Prøver blev centrifugeret, og supernatanterne blev opsamlet, oprenset som tidligere nævnt og opbevaret ved -80°C indtil analyseret. Prøver blev analyseret ved 50 μl efter en 1:10 eller 1:20 fortynding og aflæst ved 420 nm i en 96-brønds mikropladelæser. Assayet er valideret til at opnå en høj korrelation (0,95) mellem tilsatte kendte mængder af 8-isoprostan og koncentrationen målt ved EIA og er blevet direkte valideret ved gaskromatografi/massespektrometri. Antiserumet anvendt i dette assay har en 100% krydsreaktivitet med 8-iso-PGF2-alfa 0,2% hver med PGF2-alpha, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1% hver med 6-keto-PGF1-alpha. Detektionsgrænsen for assayet er 4 pg/ml, og standardkurvens område var fra 3,9 til 500 pg/ml.

Målinger af serum total p-cresol og indoxylsulfat Plasmakoncentrationer af total p-cresol sulfat (PCS) og indoxylsulfat (IS) analyseres med højtydende væskekromatografi (HPLC). Kort fortalt, til bindingskonkurrence blev 200 μl serum, hvortil vi tilsatte 20 μl 0,50 mM 1-naphthalensulfonsyre (intern standard) vortexblandet med 250 μl 0,24 M natriumoctanoat (bindingskonkurrent). Efter inkubation ved stuetemperatur tilsatte vi 25 mlmin. acetone for at udfælde proteiner. Efter vortex-blanding og centrifugering ved 4 ◦C, 1860 xg i 20 minutter, blev supernatanten overført til 12 mm x 100 mm, GL 14 glasreagensglas, og 2 ml dichlormethan blev tilsat. Efter vortex-blanding og centrifugering ved 4 ◦C, 1860×g i 10 minutter, blev 200μl af det øverste lag overført til autosampler-hætteglas af glas, efterfulgt af tilsætning af 20μl 1M HCl, og 15μl blev injiceret på HPLC. HPLC-analysen blev udført på en Agilent 1100-serie LC (Santa Clara, CA), og Agilent ChemStations-software blev brugt til den kromatografiske analyse. Adskillelsen blev udført på en ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC-søjle (5 μm, 3,0 mm×150 mm) med en flowhastighed på 0,6 ml/min. Mobil fase A er 0,2% trifluoreddikesyre i Milli-Q vand og mobil fase B er 0,2% trifluoreddikesyre i acetonitril. Den analytiske metode består af en isokratisk kørsel med 92 % mobil fase A i 23 min. Hver analytisk kørsel blev efterfulgt af en 1,3 minutters udvaskningsgradient til 100 % B. Søjletemperatur var 25 ◦C, og autosampler-bakketemperaturen var 6 ◦C. Vi kvantificerede analytterne ved at bruge analytten til standard toparealforhold på en Agilent 1100 High Performance Fluorescence detektor G1321A. Detektorindstillinger var λex 260 nm/λem288nm for p-cresylsulfat og λex 280 nm/λem 390nm for indoxylsulfat og intern standard. Kvantitative resultater opnås og beregnes i forhold til deres koncentrationer (mg/L).

Håndgrebsstyrke Muskelstyrken vurderes i den dominerende hånd ved hjælp af et Jamar hånddynamometer (Lafayette Instrument Company, USA). Patienterne bliver først bekendt med enheden og blev derefter undersøgt stående med begge arme strakt sidelæns fra kroppen med dynamometeret vendt væk fra kroppen. Patienterne blev instrueret i at gribe dynamometeret med den maksimale styrke som svar på en stemmekommando, og den højeste værdi af tre målinger blev taget i betragtning til undersøgelsen. Håndgrebsstyrke (HGS) værdier under 30. percentilen (tabel 2) fra en specifik populationsreferenceværdi justeret for alder og køn blev betragtet som reduceret [32].

Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) DEXA er en meget brugt referencemetode til krops-FFM- og FM-målinger.10 DEXA blev udført ved hjælp af et Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Helkropsscanninger blev udført i henhold til producentens instruktioner, og krops-FM (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) og knoglemineralindhold analyseres ved hjælp af producentens software. DEXA-metoden bruger et røntgenrør med et filter til at generere lavenergi (40 kV). og højenergi- (70 eller 100 kV) fotoner. Når fotonsat forskellige energiniveauer passerer gennem væv, kan deres absorptioner udtrykkes som et forhold mellem dæmpning ved lavere eller højere energiniveauer. DEXA-estimat af FFM blev beregnet som en sum af LTM- og knoglemineralindholdestimater.

Alle patienter vil blive undersøgt af den samme observatør. Generelt anbefaler AWGS at bruge 2 standardafvigelser under middelmuskelmassen for den unge referencegruppe eller den nedre kvintil som afskæringsværdibestemmelse. Desuden anbefaler AWGS at bruge højdejusteret skeletmuskelmasse i stedet for vægtjusteret skeletmuskelmasse, og de foreslåede cutoff-værdier var 7,0 kg/m2 hos mænd og 5,4 kg/m2 hos kvinder ved brug af DEXA.