Associatie van uremische sarcopenie en mitochondriaal kopieernummer en zijn klinische correlaten

Onderzoeksopzet en methoden Onderwerpen In deze studie zullen we 200 patiënten rekruteren voor onderhoudshemodialyse. Bovendien fungeren 50 qua leeftijd en geslacht overeenkomende proefpersonen als controles. De ZvH-patiënten ondergaan al minstens 3 maanden stabiele dialyse. ZvH-patiënten worden driemaal per week behandeld met standaard bicarbonaatdialyse (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) en door high-flux HD met synthetische membranen (oppervlak dialysefilters: 1,7 tot 2,1 m2). Alle ZvH-patiënten die deelnemen aan onze studie zullen worden getest met DEXA en handgreepkracht. Demografische gegevens worden verzameld en laboratoriumonderzoek wordt uitgevoerd zoals hieronder vermeld.

Biochemische bepalingen Bloedmonsters voor laboratoriumtesten werden afgenomen uit het veneuze uiteinde van een vasculaire toegang aan het begin van de hemodialysesessie en vervolgens bewaard bij -80°C tot het moment van analyse. De niveaus van hooggevoelig C-reactief proteïne (hsCRP) werden bepaald door een commerciële immunoturbidimetrische assay met behulp van een Hitachi autoanalysator (model 7170). De detectiegrens en het interval voor CRP was 0,1 mg/L en 0,1-500,0 respectievelijk mg/L. Het basislijnserumalbumine werd gemeten met de bromocresol-groenmethode op een Hitachi autoanalysator (model 7170). Serumniveaus van cholesterol, triglyceride en lipoproteïne-cholesterol met lage en hoge dichtheid werden bepaald met standaard laboratoriummethoden.

Bepaling van het relatieve aantal mtDNA-kopieën van leukocyten De real-time PCR-reactie werd voor elke reactie in drievoud uitgevoerd. De 10ul PCR-reactie bevat 1X TaqMan Universal PCR Master Mix-buffer, 500 nM van elke primer, 200 nM TaqMan-probe en 0,2-2 ng totaal genomisch DNA-extract, PCR-omstandigheden zijn 2 minuten bij 50 ℃, 10 minuten bij 95 ℃, gevolgd door 40 cycli van 15 s denaturatie bij 95 ℃ en 60 s uitgloeiing/verlenging bij 60 ℃. Realtime kwantitatieve analyse werd uitgevoerd op het StepOne Real-Time PCR-systeem (ABI). De primers en probes voor real-time PCR staan ​​vermeld in tabel 1. De PCR-producten waarbij mitochondria-DNA (MtDNA) en nucleair DNA betrokken zijn.

Standaardkromme:

Standaard DNA-oplossingen voor het mitochondriale genoom en het nucleaire 18S rRNA-dene (nDNA) werden gegenereerd uit PCR-producten die waren gekloneerd in een vector van pCR2.1-TOPO. Seriële verdunningen werden gemaakt en RT-QPCR-reacties werden uitgevoerd om de standaardkromme te construeren uit Ct-waarden en het aantal kopieën van het standaard plasmide-DNA.

Bepaling van de mtDNA/nDNA-verhouding als maat voor het mtDNA-gehalte:

Het aantal kopieën van het mtDNA en het nDNA wordt berekend met behulp van het drempelcyclusnummer (Ct) en intrapolatie van de standaardcurve. De verhouding tussen het aantal kopieën van mtDNA en het aantal kopieën van nDNA is een meting van het mtDNA-gehalte. Meting van de albumine-redoxtoestand De meting van de albumine-redoxtoestand werd uitgevoerd met behulp van de eerder beschreven high-performance liquid chromatography (HPLC)-methode [31]. Het HPLC-fluorescentiedetectiesysteem (HPLC-FD) bestond uit een AS-8010 autosampler (injectievolume, 2 ml per monster; Tosoh, Tokyo, Japan) en een model FS-8000 fluorescentiedetector (excitatiegolflengte, 280 nm; emissiegolflengte , 340 nm) met een CCPM-pomp met dubbele plunjer (Tosoh) in combinatie met een SC-8020-systeemcontroller (Tosoh). Een Shodex-Asahipak ES-502N 7C kolom [Showa Denko, Tokyo, Japan; 10×0,76 cm (binnendiameter), dimethylaminoethyl-vorm voor ionenuitwisselings-HPLC, kolomtemperatuur, 35 °C ± 0,5 °C] of in sommige gevallen twee Asahipak GS-520H kolommen [Asahi Chemical Industry; Kawasaki, Japan; 25 x 0,75 cm (binnendiameter) gehandhaafd op 32°C] werden gebruikt. Lineaire gradiëntelutie werd uitgevoerd met een ethanolgehalte dat toenam van 0% tot 5% in 0,05 M natriumacetaat en 0,40 M natriumsulfaatbuffer (pH 4,85; acetaat-sulfaatbuffer) bij een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. Ontluchting van de bufferoplossing werd uitgevoerd door heliumborrelen. Op basis van de HPLC-profielen van HSA verkregen uit deze procedures, werden de waarden voor elke fractie onderworpen aan numerieke curve-aanpassing en werden de fracties van HMA, HNA-1 en HNA-2 tot totaal HSA berekend.

Metingen van liposaccharide-bindend eiwit (LBP) De LBP werd bepaald uit serummonsters en controles met behulp van gestandaardiseerde enzymgekoppelde immunosorbentassay (ELISA)-methoden, en serum van normale controlepersonen werd gebruikt voor interassay-variatie.

Totaal van 8-iso-PGF2-alfa-analyse Totale 8-iso-PGF2-alfa-concentraties in plasma werden gemeten met een specifieke enzymimmunoassay (EIA)-kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). Monsters werden gecentrifugeerd en de supernatanten werden verzameld, gezuiverd zoals eerder vermeld en bewaard bij -80°C tot analyse. Monsters werden getest bij 50 μl na een verdunning van 1:10 of 1:20 en afgelezen bij 420 nm in een microplaatlezer met 96 putjes. De assay is gevalideerd om een ​​hoge correlatie (0,95) te verkrijgen tussen toegevoegde bekende hoeveelheden 8-isoprostaan ​​en de concentratie gemeten door EIA en is direct gevalideerd door gaschromatografie/massaspectrometrie. Het in deze test gebruikte antiserum heeft een 100% kruisreactiviteit met 8-iso-PGF2-alfa 0,2% elk met PGF2-alfa, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1% elk met 6-keto-PGF1-alfa. De detectielimiet van de assay is 4 pg/ml en het bereik van de standaardcurve was van 3,9 tot 500 pg/ml.

Metingen van serum totaal p-cresol en indoxylsulfaat Plasmaconcentraties van totaal p-cresolsulfaat (PCS) en indoxylsulfaat (IS) worden geanalyseerd met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). In het kort, voor bindingscompetitie werd 200 μl serum waaraan we 20 μl 0,50 mM 1-naftaleensulfonzuur (interne standaard) toevoegden, vortex gemengd met 250 μl 0,24 M natriumoctanoaat (bindende concurrent). Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voegden we 2 ml koud toe aceton om eiwitten neer te slaan. Na mengen op de vortex en centrifugeren bij 4 °C, 1860 x g gedurende 20 minuten, werd het supernatant overgebracht naar GL 14 glazen reageerbuizen van 12 mm x 100 mm en werd 2 ml dichloormethaan toegevoegd. Na mengen op de vortex en centrifugeren bij 4 °C, 1860 x g gedurende 10 minuten, werd 200 μl van de bovenste laag overgebracht naar glazen autosampler-flesjes, gevolgd door toevoeging van 20 μl 1 M HCl en werd 15 μl op de HPLC geïnjecteerd. De HPLC-analyse werd uitgevoerd op een Agilent 1100-serie LC (Santa Clara, CA) en Agilent ChemStations-software werd gebruikt voor de chromatografische analyse. De scheiding werd uitgevoerd op een ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC-kolom (5 urn, 3,0 mm x 150 mm) bij een stroomsnelheid van 0,6 ml/min. Mobiele fase A is 0,2% trifluorazijnzuur in Milli-Q water en mobiele fase B is 0,2% trifluorazijnzuur in acetonitril. De analytische methode bestaat uit een isocratische run met 92% mobiele fase A gedurende 23 min.. Elke analytische run werd gevolgd door een uitwasgradiënt van 1,3 min tot 100% B. De kolomtemperatuur was 25 °C en de temperatuur van de autosamplerbak was 6 °C. We kwantificeerden de analyten door de analyt tot standaard piekoppervlakverhouding te gebruiken op een Agilent 1100 High Performance Fluorescentiedetector G1321A. Detectorinstellingen waren λex 260 nm/λem288nm voor p-cresylsulfaat en λex 280 nm/λem 390nm voor indoxylsulfaat en interne standaard. Kwantitatieve resultaten worden verkregen en berekend in termen van hun concentraties (mg/L).

Handgreepkracht De spierkracht wordt gemeten in de dominante hand met behulp van een Jamar handdynamometer (Lafayette Instrument Company, VS). Patiënten worden eerst vertrouwd gemaakt met het apparaat en vervolgens staand onderzocht met beide armen zijwaarts van het lichaam gestrekt met de dynamometer van het lichaam af gericht. Patiënten kregen de instructie om de dynamometer met de maximale kracht vast te pakken als reactie op een spraakopdracht, en de hoogste waarde van drie metingen werd overwogen voor het onderzoek. Handgreepsterkte (HGS)-waarden onder het 30e percentiel (Tabel 2) van een specifieke populatiereferentiewaarde gecorrigeerd voor leeftijd en geslacht werden als verminderd beschouwd [32].

Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) DEXA is een veelgebruikte referentiemethode voor FFM- en FM-metingen van het lichaam.10 DEXA werd uitgevoerd met behulp van een Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Scans van het hele lichaam werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant en body FM (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) en botmineraalgehalte worden geanalyseerd met behulp van de software van de fabrikant. De DEXA-methode maakt gebruik van een röntgenbuis met een filter om energiezuinig (40 kV) op te wekken. en hoogenergetische (70 of 100 kV) fotonen. Wanneer fotonen met verschillende energieniveaus door weefsel gaan, kan hun absorptie worden uitgedrukt als een verhouding van verzwakking bij lagere of hogere energieniveaus. DEXA-schatting van FFM werd berekend als een som van LTM en schattingen van het botmineraalgehalte.

Alle patiënten worden door dezelfde waarnemer onderzocht. Over het algemeen raadt AWGS aan om 2 standaarddeviaties onder de gemiddelde spiermassa van de jonge referentiegroep of het onderste kwintiel te gebruiken als bepaling van de afkapwaarde. Bovendien beveelt AWGS het gebruik van in hoogte aangepaste skeletspiermassa aan in plaats van op gewicht aangepaste skeletspiermassa, en de voorgestelde afkapwaarden waren 7,0 kg/m2 bij mannen en 5,4 kg/m2 bij vrouwen bij gebruik van DEXA.