Association de la sarcopénie urémique et du nombre de copies mitochondriales et de ses corrélats cliniques

Design et méthodes de recherche Sujets Dans cette étude, nous allons recruter 200 patients sous hémodialyse d'entretien. De plus, 50 sujets appariés selon l'âge et le sexe servent de témoins. Les patients HD sont sous dialyse stable depuis au moins 3 mois Les patients HD sont traités trois fois par semaine avec une dialyse standard au bicarbonate (Na 138 mmol/L, HCO3 35 mmol/L, K 1,5 mmol/L, Ca 1,25 mmol/L, Mg 0,75 mmol/L) et par HD haut débit avec membranes synthétiques (surface des filtres de dialyse : 1,7 à 2,1 m2). Tous les patients HD inscrits dans notre étude seront testés avec DEXA et la force de la poignée. Des données démographiques seront recueillies et des examens de laboratoire seront effectués comme indiqué ci-dessous.

Déterminations biochimiques Des échantillons de sang pour les tests de laboratoire ont été prélevés à l'extrémité veineuse d'un accès vasculaire au début de la séance d'hémodialyse, puis conservés à -80°C jusqu'au moment de l'analyse. Les taux de protéine C-réactive hautement sensible (hsCRP) ont été déterminés par un test immunoturbidimétrique commercial utilisant un autoanalyseur Hitachi (modèle 7170). La limite et l'intervalle de détection pour la CRP étaient de 0,1 mg/L et de 0,1 à 500,0 mg/L, respectivement. L'albumine sérique de base a été mesurée par la méthode au vert de bromocrésol sur un autoanalyseur Hitachi (modèle 7170). Les taux sériques de cholestérol, de triglycérides et de cholestérol des lipoprotéines de basse et de haute densité ont été déterminés par des méthodes de laboratoire standard.

Détermination du nombre relatif de copies d'ADNmt de leucocytes La réaction de PCR en temps réel a été réalisée en triple pour chaque réaction. La réaction PCR 10ul contient 1X TaqMan Universal PCR Master Mix buffer, 500nM de chaque amorce, 200nM de sonde TaqMan et 0,2-2ng d'extrait d'ADN génomique total, les conditions de PCR sont de 2 min à 50℃, 10 min à 95℃, suivi de 40 cycles de 15 s de dénaturation à 95℃ et 60 s de recuit/extension à 60℃. L'analyse quantitative en temps réel a été effectuée sur le système de PCR en temps réel StepOne (ABI). Les amorces et les sondes pour la PCR en temps réel sont répertoriées dans le tableau 1. Les produits de PCR qui impliquent l'ADN mitochondrial (ADNMt) et l'ADN nucléaire.

Courbe standard :

Des solutions d'ADN standard pour le génome mitochondrial et l'ARNr nucléaire 18S (ADNn) ont été générées à partir de produits de PCR clonés dans un vecteur de pCR2.1-TOPO. Des dilutions en série ont été réalisées et des réactions RT-QPCR ont été réalisées pour construire la courbe standard à partir des valeurs Ct et du nombre de copies de l'ADN plasmidique standard.

Détermination du rapport ADNmt/ADNn comme mesure de la teneur en ADNmt :

Le nombre de copies de l'ADNmt et de l'ADNn est calculé en utilisant le nombre de cycles seuil (Ct) et en intrapolant à partir de la courbe standard. Le rapport du nombre de copies d'ADNmt au nombre de copies d'ADNn est la mesure de la teneur en ADNmt.[30] Mesure de l'état redox de l'albumine La mesure de l'état redox de l'albumine a été réalisée en utilisant la méthode de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) rapportée précédemment [31]. Le système de détection de fluorescence HPLC (HPLC-FD) se composait d'un échantillonneur automatique AS-8010 (volume d'injection, 2 ml par échantillon ; Tosoh, Tokyo, Japon) et d'un détecteur de fluorescence modèle FS-8000 (longueur d'onde d'excitation, 280 nm ; longueur d'onde d'émission , 340 nm) avec une pompe à double piston CCPM (Tosoh) en conjonction avec un contrôleur de système SC-8020 (Tosoh). Une colonne Shodex-Asahipak ES-502N 7C [Showa Denko, Tokyo, Japon ; 10 × 0,76 cm (diamètre interne), forme diméthylaminoéthyle pour CLHP échangeuse d'ions, température de la colonne, 35 °C ± 0,5 °C] ou dans certains cas deux colonnes Asahipak GS-520H [Asahi Chemical Industry ; Kawasaki, Japon ; 25 x 0,75 cm (diamètre intérieur) maintenus à 32°C] ont été utilisés. L'élution en gradient linéaire a été réalisée avec un niveau d'éthanol passant de 0 % à 5 % dans un tampon acétate de sodium 0,05 M et sulfate de sodium 0,40 M (pH 4,85 ; tampon acétate-sulfate) à un débit de 1,0 mL/min. La désaération de la solution tampon a été réalisée par barbotage d'hélium. Sur la base des profils HPLC de HSA obtenus à partir de ces procédures, les valeurs de chaque fraction ont été soumises à un ajustement de courbe numérique, et les fractions de HMA, HNA-1 et HNA-2 par rapport à la HSA totale ont été calculées.

Mesures de la protéine de liaison aux liposaccharides (LBP) La LBP a été déterminée à partir d'échantillons de sérum et de témoins à l'aide de méthodes standardisées de dosage immuno-enzymatique (ELISA), et le sérum de sujets témoins normaux a été utilisé pour la variation entre les tests.

Analyse totale de 8-iso-PGF2-alpha Les concentrations totales de 8-iso-PGF2-alpha dans le plasma ont été mesurées par un kit spécifique d'immunodosage enzymatique (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). Les échantillons ont été centrifugés et les surnageants ont été collectés, purifiés comme indiqué précédemment et stockés à -80°C jusqu'au dosage. Les échantillons ont été dosés à 50 μl après une dilution 1:10 ou 1:20 et lus à 420 nm dans un lecteur de microplaques à 96 puits. Le test a été validé pour obtenir une corrélation élevée (0,95) entre les quantités ajoutées connues de 8-isoprostane et la concentration mesurée par EIA et a été directement validé par chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse. L'antisérum utilisé dans ce test a une réactivité croisée de 100 % avec 8-iso-PGF2-alpha 0,2 % chacun avec PGF2-alpha, PGF3, PGE1, PGE2, 0,1 % chacun avec 6-céto-PGF1-alpha. La limite de détection du test est de 4 pg/ml et la plage de la courbe standard était de 3,9 à 500 pg/ml.

Mesures du p-crésol total sérique et du sulfate d'indoxyle Les concentrations plasmatiques de sulfate de p-crésol total (PCS) et de sulfate d'indoxyle (IS) sont analysées par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). En bref, pour la compétition de liaison, 200 μl de sérum auxquels nous avons ajouté 20 μl d'acide 1-naphtalènesulfonique 0,50 mM (étalon interne) ont été mélangés au vortex avec 250 μl d'octanoate de sodium 0,24 M (compétiteur de liaison). Après incubation à température ambiante pendant 5 min, nous avons ajouté 2 ml d'eau froide. l'acétone pour précipiter les protéines. Après mélange au vortex et centrifugation à 4 °C, 1860 x g pendant 20 min, le surnageant a été transféré dans des tubes à essai en verre GL 14 de 12 mm x 100 mm et 2 ml de dichlorométhane ont été ajoutés. Après mélange au vortex et centrifugation à 4 °C, 1860 × g pendant 10 min, 200 μl de la couche supérieure ont été transférés dans des flacons en verre pour échantillonneur automatique, suivis de l'ajout de 20 μl de HCl 1M et 15 μl ont été injectés sur la HPLC. L'analyse HPLC a été effectuée sur un LC Agilent série 1100 (Santa Clara, CA) et le logiciel Agilent ChemStations a été utilisé pour l'analyse chromatographique. La séparation a été réalisée sur une colonne HPLC ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus (5 µm, 3,0 mm x 150 mm) à un débit de 0,6 ml/min. La phase mobile A est de l'acide trifluoroacétique à 0,2 % dans de l'eau Milli-Q et la phase mobile B est de l'acide trifluoroacétique à 0,2 % dans de l'acétonitrile. La méthode analytique consiste en un run isocratique avec 92% de phase mobile A pendant 23 min. Chaque analyse a été suivie d'un gradient de lavage de 1,3 min jusqu'à 100 % de B. La température de la colonne était de 25 ◦C et la température du plateau de l'échantillonneur automatique était de 6 ◦C. Nous avons quantifié les analytes en utilisant le rapport analyte sur surface de pic standard sur un détecteur de fluorescence haute performance Agilent 1100 G1321A. Les réglages du détecteur étaient λex 260 nm/λem288nm pour le sulfate de p-crésyle et λex 280 nm/λem 390nm pour le sulfate d'indoxyle et l'étalon interne. Des résultats quantitatifs sont obtenus et calculés en fonction de leurs concentrations (mg/L).

Force de préhension La force musculaire est évaluée dans la main dominante à l'aide d'un dynamomètre à main Jamar (Lafayette Instrument Company, USA). Les patients sont d'abord familiarisés avec l'appareil et sont ensuite examinés debout, les deux bras tendus latéralement par rapport au corps, le dynamomètre tourné à l'opposé du corps. Les patients ont été invités à saisir le dynamomètre avec la force maximale en réponse à une commande vocale, et la valeur la plus élevée de trois mesures a été prise en compte pour l'étude. Les valeurs de force de préhension (HGS) inférieures au 30e centile (tableau 2) à partir d'une valeur de référence de population spécifique ajustée pour l'âge et le sexe ont été considérées comme réduites [32].

Absorptiométrie à rayons X à double énergie (DEXA) La DEXA est une méthode de référence largement utilisée pour les mesures FFM et FM corporelles.10 La DEXA a été réalisée à l'aide d'un Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Madison, WI). Des scintigraphies du corps entier ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant, et la FM corporelle (FMDEXA), la LTM (LTMDEXA) et la teneur en minéraux osseux sont analysées à l'aide du logiciel du fabricant. La méthode DEXA utilise un tube à rayons X avec un filtre pour générer une faible énergie (40 kV). et des photons de haute énergie (70 ou 100 kV). Lorsque des photons à différents niveaux d'énergie traversent les tissus, leurs absorptions peuvent être exprimées sous la forme d'un rapport d'atténuation à des niveaux d'énergie inférieurs ou supérieurs. L'estimation DEXA de la FFM a été calculée comme une somme des estimations de la teneur minérale LTM et osseuse.

Tous les patients seront examinés par le même observateur. Dans l'ensemble, l'AWGS recommande d'utiliser 2 écarts-types en dessous de la masse musculaire moyenne du groupe de référence jeune ou du quintile inférieur comme détermination de la valeur seuil. De plus, l'AWGS recommande d'utiliser la masse musculaire squelettique ajustée en hauteur au lieu de la masse musculaire squelettique ajustée en fonction du poids, et les valeurs seuils suggérées étaient de 7,0 kg/m2 chez les hommes et de 5,4 kg/m2 chez les femmes en utilisant DEXA.