Ассоциация уремической саркопении с числом копий митохондрий и ее клиническими коррелятами

Дизайн и методы исследования Субъекты В это исследование мы наберем 200 пациентов, находящихся на поддерживающем гемодиализе. Кроме того, контрольной группой выступали 50 человек того же возраста и пола. Пациенты с ГД находились на стабильном диализе не менее 3 месяцев. Пациенты с ГД трижды в неделю получали стандартный бикарбонатный диализ (Na 138 ммоль/л, HCO3 35 ммоль/л, K 1,5 ммоль/л, Ca 1,25 ммоль/л, Mg 0,75 ммоль/л) и высокопроницаемым ГД с синтетическими мембранами (площадь диализных фильтров: от 1,7 до 2,1 м2). Все пациенты с ГБ, включенные в наше исследование, будут проверены с помощью DEXA и силы хвата. Будут собраны демографические данные и проведено лабораторное обследование, как указано ниже.

Биохимические определения Образцы крови для лабораторных исследований брали из венозного конца сосудистого доступа в начале сеанса гемодиализа и затем хранили при -80°C до времени проведения анализа. Уровни высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP) определяли с помощью коммерческого иммунотурбидиметрического анализа с использованием автоанализатора Hitachi (модель 7170). Предел и интервал обнаружения для СРБ составил 0,1 мг/л и 0,1-500,0 мг/л соответственно. Исходный уровень сывороточного альбумина измеряли методом бромкрезолового зеленого на автоанализаторе Hitachi (модель 7170). Сывороточные уровни холестерина, триглицеридов и холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности определяли стандартными лабораторными методами.

Определение относительного количества копий мтДНК лейкоцитов Реакцию ПЦР в реальном времени проводили в трех экземплярах для каждой реакции. Реакция ПЦР 10 мкл содержит 1X буфер TaqMan Universal PCR Master Mix, 500 нМ каждого праймера, 200 нМ зонда TaqMan и 0,2-2 нг экстракта общей геномной ДНК. Условия ПЦР: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 40 циклов по 15 с денатурации при 95 ℃ и 60 с отжига/удлинения при 60 ℃. Количественный анализ в реальном времени выполняли на системе StepOne Real-Time PCR (ABI). Праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени перечислены в таблице 1. Продукты ПЦР, которые включают митохондриальную ДНК (МтДНК) и ядерную ДНК.

Стандартная кривая:

Стандартные растворы ДНК для митохондриального генома и ядерной 18S рРНК дене (яДНК) были созданы из продуктов ПЦР, клонированных в векторе pCR2.1-TOPO. Делали серийные разведения и проводили реакции RT-QPCR для построения стандартной кривой по значениям Ct и количеству копий стандартной плазмидной ДНК.

Определение соотношения мтДНК/нДНК как меры содержания мтДНК:

Количество копий мтДНК и яДНК рассчитывается с использованием порогового числа циклов (Ct) и интраполяции стандартной кривой. Отношение количества копий мтДНК к количеству копий яДНК является мерой содержания мтДНК.[30] Измерение окислительно-восстановительного состояния альбумина Измерение окислительно-восстановительного состояния альбумина проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), описанного ранее [31]. Система ВЭЖХ-флуоресцентного детектирования (ВЭЖХ-ФД) состояла из автоматического пробоотборника AS-8010 (объем ввода 2 мл на образец; Tosoh, Токио, Япония) и детектора флуоресценции модели FS-8000 (длина волны возбуждения 280 нм; длина волны испускания , 340 нм) с двухплунжерным насосом CCPM (Tosoh) в сочетании с системным контроллером SC-8020 (Tosoh). Колонка Shodex-Asahipak ES-502N 7C [Showa Denko, Токио, Япония; 10×0,76 см (внутренний диаметр), диметиламиноэтил-форма для ионообменной ВЭЖХ, температура колонки 35°С±0,5°С] или, в некоторых случаях, две колонки Asahipak GS-520H [Asahi Chemical Industry; Кавасаки, Япония; 25×0,75 см (внутренний диаметр), поддерживаемые при 32°C]. Линейно-градиентное элюирование проводили с повышением уровня этанола от 0% до 5% в 0,05 М ацетате натрия и 0,40 М буфере сульфата натрия (pH 4,85; ацетат-сульфатный буфер) при скорости потока 1,0 мл/мин. Деаэрацию буферного раствора проводили барботированием гелием. На основании профилей ВЭЖХ HSA, полученных с помощью этих процедур, значения для каждой фракции подвергали численному подбору кривой, и рассчитывали доли HMA, HNA-1 и HNA-2 по отношению к общему количеству HSA.

Измерения липосахарид-связывающего белка (LBP) LBP определяли из образцов сыворотки и контролей с использованием стандартизированных методов иммуноферментного анализа (ELISA), а сыворотку здоровых контрольных субъектов использовали для вариации между анализами.

Общий анализ 8-изо-PGF2-альфа. Общие концентрации 8-изо-PGF2-альфа в плазме измеряли с помощью набора для иммуноферментного анализа (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich). Образцы центрифугировали и супернатанты собирали, очищали, как указано выше, и хранили при -80°C до анализа. Образцы анализировали по 50 мкл после разбавления 1:10 или 1:20 и считывали при 420 нм в 96-луночном ридере для микропланшетов. Анализ был подтвержден для получения высокой корреляции (0,95) между добавленными известными количествами 8-изопростана и концентрацией, измеренной с помощью EIA, и был непосредственно подтвержден с помощью газовой хроматографии/масс-спектрометрии. Антисыворотка, используемая в этом анализе, имеет 100% перекрестную реактивность с 8-изо-PGF2-альфа, по 0,2% с каждым из PGF2-альфа, PGF3, PGE1, PGE2, по 0,1% с каждым из 6-кето-PGF1-альфа. Предел обнаружения анализа составляет 4 пг/мл, а диапазон стандартной кривой – от 3,9 до 500 пг/мл.

Измерения общего п-крезола и индоксилсульфата в сыворотке Концентрации общего п-крезолсульфата (PCS) и индоксилсульфата (IS) в плазме анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вкратце, для конкурентного связывания 200 мкл сыворотки, к которой мы добавили 20 мкл 0,50 мМ 1-нафталинсульфоновой кислоты (внутренний стандарт), смешивали на вортексе с 250 мкл 0,24 М октаноата натрия (связывающий конкурент). После инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут мы добавили 2 мл холодного ацетона для осаждения белков. После перемешивания на вортексе и центрифугирования при 4°C, 1860×g в течение 20 минут надосадочную жидкость переносили в 12 мм×100 мм стеклянные пробирки GL 14 и добавляли 2 мл дихлорметана. После вортексного перемешивания и центрифугирования при 4°C, 1860×g в течение 10 мин 200 мкл верхнего слоя переносили в стеклянные флаконы для автоматического пробоотборника с последующим добавлением 20 мкл 1М HCl и 15 мкл вводили на ВЭЖХ. Анализ ВЭЖХ проводили на ЖХ Agilent серии 1100 (Санта-Клара, Калифорния), а для хроматографического анализа использовали программное обеспечение Agilent ChemStations. Разделение проводили на колонке для ВЭЖХ ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus (5 мкм, 3,0 мм × 150 мм) при скорости потока 0,6 мл/мин. Подвижная фаза А представляет собой 0,2% трифторуксусной кислоты в воде Milli-Q, а подвижная фаза В представляет собой 0,2% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. Аналитический метод состоит из изократического анализа с 92% подвижной фазы А в течение 23 минут. За каждым аналитическим прогоном следовал 1,3-минутный градиент вымывания до 100% B. Температура колонки составляла 25 ◦C, а температура лотка автоматического пробоотборника составляла 6 ◦C. Мы провели количественную оценку аналитов, используя соотношение площади пика аналита и стандарта на высокоэффективном флуоресцентном детекторе Agilent 1100 G1321A. Настройки детектора: λex 260 нм/λem 288 нм для п-крезилсульфата и λex 280 нм/λem 390 нм для индоксилсульфата и внутреннего стандарта. Количественные результаты получают и рассчитывают по их концентрациям (мг/л).

Сила хвата. Силу мышц оценивают в ведущей руке с помощью кистевого динамометра Jamar (Lafayette Instrument Company, США). Сначала пациенты знакомятся с устройством, а затем обследуются в положении стоя с обеими руками, вытянутыми в стороны от тела, при этом динамометр направлен в сторону от тела. Пациентов инструктировали сжимать динамометр с максимальной силой в ответ на голосовую команду, и для исследования учитывалось наибольшее значение из трех измерений. Значения силы хвата (HGS) ниже 30-го процентиля (таблица 2) от эталонного значения для конкретной популяции, скорректированного с учетом возраста и пола, считались сниженными [32].

Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (DEXA) DEXA является широко используемым эталонным методом для измерений FFM и FM тела.10 DEXA выполняли с использованием Lunar Prodigy (GE Medical Systems, Мэдисон, Висконсин). Сканирование всего тела выполняли в соответствии с инструкциями производителя, а FM тела (FMDEXA), LTM (LTMDEXA) и содержание минералов в костях анализировали с использованием программного обеспечения производителя. Метод DEXA использует рентгеновскую трубку с фильтром для генерации низкой энергии (40 кВ). и фотоны высокой энергии (70 или 100 кВ). Когда фотоны с разными уровнями энергии проходят через ткань, их поглощение может быть выражено как отношение затухания на более низких или более высоких уровнях энергии. Оценку DEXA для FFM рассчитывали как сумму оценок LTM и содержания минералов в костях.

Всех пациентов будет осматривать один и тот же наблюдатель. В целом, AWGS рекомендует использовать 2 стандартных отклонения ниже средней мышечной массы молодой контрольной группы или нижнего квинтиля в качестве определения порогового значения. Более того, AWGS рекомендует использовать массу скелетных мышц с поправкой на рост вместо массы скелетных мышц с поправкой на вес, а предложенные пороговые значения составили 7,0 кг/м2 у мужчин и 5,4 кг/м2 у женщин при использовании DEXA.