Uremic Sarcopenia와 Mitochondrial Copy Number의 연관성과 임상 상관 관계

연구 설계 및 방법 주제 이 연구에서 우리는 유지 혈액 투석을 받는 200명의 환자를 모집할 것입니다. 또한 연령 및 성별이 일치하는 50명의 피험자가 대조군 역할을 합니다. HD 환자는 최소 3개월 동안 안정적인 투석을 받았습니다 HD 환자는 표준 중탄산염 투석(Na 138mmol/L, HCO3 35mmol/L, K 1.5mmol/L, Ca 1.25mmol/L, Mg 0.75mmol/L) 및 합성 막(투석 필터 표면적: 1.7 ~ 2.1m2)이 있는 고유량 HD에 의해. 우리 연구에 등록한 모든 HD 환자는 DEXA와 악력으로 테스트됩니다. 인구 통계학적 데이터가 수집되고 실험실 검사가 아래에 나열된 대로 수행됩니다.

생화학적 결정 실험실 테스트를 위한 혈액 샘플은 혈액 투석 세션 시작 시 혈관 통로의 정맥 끝에서 채취한 다음 분석 시간까지 -80°C에서 보관했습니다. 고감도 C-반응성 단백질(hsCRP) 수준은 Hitachi autoanalyzer(모델 7170)를 사용하여 상업적인 면역 비탁 측정법에 의해 결정되었습니다. CRP의 검출 한계 및 간격은 0.1 mg/L 및 0.1-500.0 각각 mg/L입니다. 베이스라인 혈청 알부민은 Hitachi autoanalyzer(모델 7170)에서 bromocresol green 방법으로 측정되었습니다. 콜레스테롤, 트리글리세리드, 저밀도 및 고밀도 지단백 콜레스테롤의 혈청 수치는 표준 실험실 방법으로 결정되었습니다.

상대적인 백혈구 mtDNA 카피 수 결정 Real-Time PCR 반응은 각 반응에 대해 3회 수행되었습니다. 10ul PCR reaction은 1X TaqMan Universal PCR Master Mix buffer, 각 primer 500nM, TaqMan probe 200nM, total genomic DNA extract 0.2-2ng을 포함하며, PCR 조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 후, 95℃에서 15초 변성 및 60℃에서 60초 어닐링/연신의 40주기. 실시간 정량분석은 StepOne Real-Time PCR system(ABI)에서 수행하였다. 실시간 PCR을 위한 프라이머 및 프로브는 표 1에 나열되어 있습니다. 미토콘드리아 DNA(MtDNA)와 핵 DNA를 포함하는 PCR 제품.

표준 곡선:

pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝된 PCR 산물로부터 미토콘드리아 게놈 및 nDNA(nuclear 18S rRNA dene)에 대한 표준 DNA 솔루션을 생성했습니다. 일련의 희석액을 만들고 RT-QPCR 반응을 수행하여 Ct 값과 표준 플라스미드 DNA의 복제 수로부터 표준 곡선을 구성했습니다.

mtDNA 함량 측정으로서 mtDNA/nDNA 비율 결정:

mtDNA 및 nDNA의 카피 수는 임계 사이클 수(Ct)를 사용하고 표준 곡선에서 내삽하여 계산됩니다. nDNA의 카피 수에 대한 mtDNA의 카피 수의 비율은 mtDNA 함량의 측정입니다.[30] 알부민 산화환원 상태 측정 알부민 산화환원 상태 측정은 이전에 보고된 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 방법을 사용하여 수행하였다[31]. HPLC-형광 검출(HPLC-FD) 시스템은 AS-8010 오토샘플러(주입량, 시료당 2mL, Tosoh, Tokyo, Japan) 및 모델 FS-8000 형광 검출기(여기 파장, 280nm, 방출 파장)로 구성되었습니다. , 340nm) SC-8020 시스템 컨트롤러(Tosoh)와 함께 CCPM 이중 플런저 펌프(Tosoh)를 사용합니다. A Shodex-Asahipak ES-502N 7C 칼럼 [Showa Denko, Tokyo, Japan; 10×0.76cm(내경), 이온 교환 HPLC용 디메틸아미노에틸형, 컬럼 온도, 35℃±0.5℃] 또는 어떤 경우에는 두 개의 Asahipak GS-520H 컬럼[Asahi Chemical Industry; 가와사키, 일본; 32℃에서 유지된 25×0.75cm(내경)]을 사용하였다. 1.0 mL/분의 유속으로 0.05 M 아세트산나트륨 및 0.40 M 황산나트륨 완충액(pH 4.85; 아세테이트-황산염 완충액)에서 에탄올 수준을 0%에서 5%로 증가시키면서 선형 구배 용출을 수행하였다. 완충 용액의 탈기는 헬륨 버블링에 의해 수행되었다. 이러한 절차에서 얻은 HSA의 HPLC 프로파일을 기반으로 각 분획의 값을 수치 곡선 맞춤에 적용하고 전체 HSA에 대한 HMA, HNA-1 및 HNA-2의 분율을 계산했습니다.

Liposaccharide-binding protein (LBP)의 측정 LBP는 표준화된 ELISA(enzymelinked immunosorbent assay) 방법을 사용하여 혈청 샘플과 대조군에서 결정되었고, 정상 대조군 대상의 혈청은 분석간 변이에 사용되었습니다.

총 8-이소-PGF2-알파 분석 혈장 내 총 8-이소-PGF2-알파 농도를 특정 효소 면역분석(EIA) 키트(Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich)로 측정하였다. 샘플을 원심분리하고 상청액을 수집하고 앞서 언급한 바와 같이 정제하고 분석할 때까지 -80°C에서 보관했습니다. 샘플을 1:10 또는 1:20 희석 후 50μl에서 분석하고 96웰 마이크로플레이트 판독기에서 420nm에서 판독했습니다. 분석은 8-isoprostane의 추가 알려진 양과 EIA에 의해 측정된 농도 사이의 높은 상관 관계(0.95)를 얻기 위해 검증되었으며 가스 크로마토그래피/질량 분석법에 의해 직접 검증되었습니다. 이 분석에 사용된 항혈청은 8-iso-PGF2-alpha와 각각 0.2%, PGF2-alpha, PGF3, PGE1, PGE2와 각각 0.1%, 6-keto-PGF1-alpha와 100% 교차 반응성을 나타냅니다. 분석의 검출 한계는 4 pg/ml이고 표준 곡선의 범위는 3.9에서 500 pg/ml입니다.

혈청 총 p-크레졸 및 인독실 황산염 측정 총 p-크레졸 황산염(PCS) 및 인독실 황산염(IS)의 혈장 농도를 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 간략하게, 결합 경쟁을 위해, 우리가 20μl 0.50mM 1-나프탈렌설폰산(내부 표준)을 첨가한 200μl 혈청을 250μl 0.24M 옥탄산나트륨(결합 경쟁자)과 와류 혼합했습니다. 단백질을 침전시키는 아세톤. 4℃, 1860×g에서 20분 동안 vortex-mixing 및 centrifuging 후 상등액을 12mm×100mm로 옮기고 GL 14 유리 시험관과 2ml dichloromethane을 첨가하였다. 4℃, 1860×g에서 10분 동안 vortex-mixing 및 원심분리한 후, 상층 200μl를 유리 오토샘플러 바이알로 옮긴 다음 20μl 1M HCl을 첨가하고 15μl를 HPLC에 주입했습니다. HPLC 분석은 Agilent 1100 시리즈 LC(Santa Clara, CA)에서 수행되었으며 Agilent ChemStations 소프트웨어는 크로마토그래피 분석에 사용되었습니다. ZORBAX SB-C18 Solv Saver Plus HPLC 컬럼(5μm, 3.0mm x 150mm)에서 0.6ml/분의 유속으로 분리를 수행하였다. 이동상 A는 Milli-Q 물에 포함된 0.2% 트리플루오로아세트산이고 이동상 B는 아세토니트릴에 포함된 0.2% 트리플루오로아세트산입니다. 분석 방법은 23분 동안 92% 이동상 A를 사용한 등용매 실행으로 구성됩니다. 각 분석 실행 후 100% B까지 1.3분의 세척 구배가 뒤따랐습니다. 컬럼 온도는 25ºC, 자동 시료 주입기 트레이 온도는 6ºC였습니다. Agilent 1100 고성능 형광 검출기 G1321A에서 표준 피크 면적 비율에 대한 분석 물질을 사용하여 분석 물질을 정량화했습니다. 검출기 설정은 p-크레실 설페이트의 경우 λex 260 nm/λem288nm, 인독실 설페이트 및 내부 표준의 경우 λex 280 nm/λem 390nm였습니다. 정량적 결과를 얻고 농도(mg/L)로 계산합니다.

손잡이 근력 Jamar 손 동력계(Lafayette Instrument Company, USA)를 사용하여 우세한 손에서 근력을 평가합니다. 환자는 먼저 장치에 익숙해진 다음 양팔을 몸에서 옆으로 뻗고 동력계가 몸 반대쪽을 향하도록 서서 검사했습니다. 환자는 음성 명령에 따라 최대 힘으로 동력계를 잡도록 지시받았고, 3회 측정값 중 가장 높은 값을 연구에 고려하였다. 연령과 성별에 맞게 조정된 특정 모집단 기준 값에서 30번째 백분위수(표 2) 미만의 핸드그립 강도(HGS) 값은 감소된 것으로 간주되었습니다[32].

Dual-Energy X-ray Absorptiometry(DEXA) DEXA는 신체 FFM 및 FM 측정에 널리 사용되는 기준 방법입니다.10 DEXA는 Lunar Prodigy(GE Medical Systems, Madison, WI)를 사용하여 수행되었습니다. 제조업체의 지침에 따라 전신 스캔을 수행하고 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 신체 FM(FMDEXA), LTM(LTMDEXA) 및 뼈 미네랄 함량을 분석합니다. DEXA 방법은 저에너지(40kV)를 생성하기 위해 필터가 있는 X선관을 사용합니다. 및 고에너지(70 또는 100kV) 광자. 서로 다른 에너지 수준의 광자가 조직을 통과할 때 흡수는 더 낮거나 더 높은 에너지 수준에서 감쇠 비율로 표현될 수 있습니다. FFM의 DEXA 추정치는 LTM과 뼈 미네랄 함량 추정치의 합으로 계산되었습니다.

모든 환자는 동일한 관찰자가 검사합니다. 전반적으로 AWGS는 젊은 기준 그룹 또는 하위 5분위의 평균 근육량보다 2 표준 편차를 컷오프 값 결정으로 사용할 것을 권장합니다. 또한 AWGS에서는 체중보정 골격근량 대신 신장보정 골격근량 사용을 권장하고 있으며, DEXA를 사용하여 제시한 컷오프 값은 남성 7.0kg/m2, 여성 5.4kg/m2였다.