肝硬変患者における COVID-19 の予防のための非複製 ChAdOx1 ベクターワクチン AZD1222 (COVISHIELD) の安全性と有効性

• 研究集団: グループ 1: 肝硬変 グループ 2: コントロール グループ (健常者)
• 研究デザイン: 単一センター、パイロット研究、適応型臨床試験
• 学習期間：1年間、入学時期：2021年3月～2021年8月
• 正当化されたサンプル サイズ:

試験はパイロットスタディとして実施されています。 両グループとも先着100名様となります。 ただし、予備分析は、各グループに 50 人の参加者が登録された後に行われます。 研究は適応臨床試験として実施されています。

• 介入：

  AZD1222(Covishield) の 2 回の IM 投与 (0.5 mL) を 0 日目と最初の投与の 6 ～ 8 週間後 (42 ～ 56 日目) に行います。 このスケジュールは、最初の 100 人の参加者に適用されます。その後、適応型臨床試験の一環として、一般的な政府のプロトコルに従ってワクチン接種スケジュールが適用されます。

• モニタリングと評価:

SARS CoV2 血清 IgG レベルと中和抗体力価:

ベースライン時（初回投与前）、28日目（初回投与後4週間/28日後、2回目投与直前）、8週間後（または2回目投与後4週間）、16週間後（または2回目投与後12週間）の血液サンプル、28 週（または 2 回目の接種後 24 週間）、40 週（または 2 回目の接種後 36 週間）、および 52 週間（または 2 回目の接種後 48 週間）化学発光イムノアッセイ (CLIA) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA) VITROS ECi/ECiQ/3600 自動装置。 結果は、血清/カットオフ比 ≥ 1 で反応性、S/Co 比が 1 未満で非反応性として表されます。

すべての反応性サンプルをさらに処理して、サロゲート ウイルス中和試験 ELISA ベースの商用アッセイ (sVNT) (GenScript cPass™ SARS-CoV-2 中和抗体検出キット) を利用して中和抗体力価を測定し、スパイクタンパク質に対する中和抗体応答を探します。ウイルスの。

SARS CoV-2 感染のリアルタイム PCR:

SARSCoV-2感染の診断は、ウイルス輸送培地で収集された鼻咽頭および口腔スワブを組み合わせたリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）の実行、およびSARSの少なくとも2つの特定の遺伝子標的の検出によって確認されます。 CoV-2 ウイルス (E および RdRP 遺伝子)。

一次 IFN-γ ELISPOT アッセイ。 ベースライン時（初回投与前）、28日目（初回投与後4週間/28日後、2回目投与直前）、8週間後（または2回目投与後4週間）、16週間後（または2回目投与後12週間）の血液サンプル、28週（または2回目の投与後24週間）、40週間（または2回目の投与後36週間）、および52週間（または2回目の投与後48週間）が収集されます。 主に、抗原特異的 T 細胞を列挙するための ex-vivo インターフェロン-γ 酵素結合免疫スポット (ELISpot) アッセイを使用して、細胞応答を評価します。 簡単に言えば、密度勾配遠心分離によって全血から PBMC を分離し、直ちに 90% ウシ胎児血清および 10% ジメチルスルホキシドで凍結保存し、保存のために液体窒素に移します。

IFN-γ ELISPOT アッセイは、凍結保存された PBMC を使用して実行されます。 簡単に説明すると、未分画の PBMC を解凍し、DMEM 培地に 1 × 106 細胞/ml の濃度で再懸濁し、ニトロセルロースで裏打ちされた 96 ウェル プレートに 100 μl/ウェル (1 × 105 細胞/ウェル) で播種します ( Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）は、抗ＩＦＮ－γモノクローナル抗体（１－Ｄ１Ｋ、５μｇ／ｍｌ；Ｍａｂｔｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のＰＢＳ溶液で予めコーティングされている。 陰性対照として、異なる細胞刺激 (PMA; フィトヘマグルチニン 1 μg/ml およびイオノマイシン) を陽性対照として使用します。 次に、プレートを 37°C で 40 時間インキュベートし、回収して ELISPOT リーダーで読み取ります。 ワクチン誘発反応は、個々のエピトープペプチドに対するベースライン反応の 3 倍以上の増加として定義されます。

T細胞の機能:

ベースライン時（初回投与前）、28日目（初回投与後4週間/28日後、2回目投与直前）、8週間後（または2回目投与後4週間）、16週間後（または2回目投与後12週間）の血液サンプル、28週間（または2回目の投与の24週間後）、40週間（または2回目の投与の36週間後）および52週間（または2回目の投与の48週間後） 免疫反応の測定値は、まったく得られた末梢血単核細胞（PBMC）を使用して評価されます時点。

CD4 および CD8 T 細胞の機能を調べるために、PBMC を 10% FBS を含む RPMI 培地で 96 ウェル プレートで培養します。ダルムシュタット、ドイツ) および 10 μg/ml LPS (メルク、ダルムシュタット、ドイツ) で、37°C​​、5% CO2 で 6 ～ 7 時間。 １時間のインキュベーション後、１μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）をすべてのウェルに添加する。 インキュベーション後、抗CD3FITC、抗CD8BV421および抗CD4 PE/cyanine5.5 (Cy5)で細胞を25～30分間表面染色し、続いて100 μLの透過処理溶液(BD Biosciences、米国)で10分間透過処理します。 500 μL 1x サイトパームで 2 回洗浄されます。 洗浄後、抗IL2 APC、抗IFN-γ PE、抗IL-17 PE-Cy7 (BD Biosciences and Pharmingen, USA ）、25 ～ 30 分間インキュベートした後、PBS で洗浄し、BD Verse フローサイトメーターで取得する前に 0.1 % PFA で細胞を固定します。 データは、FlowJo ソフトウェア バージョン 10 を使用して分析されます。

単球の表現型と機能の切り替え:

ベースライン時（初回投与前）、28日目（初回投与後4週間/28日後、2回目投与直前）、8週間後（または2回目投与後4週間）、16週間後（または2回目投与後12週間）の血液サンプル、28 週（または 2 回目の接種後 24 週間）、40 週（または 2 回目の接種後 36 週間）、および 52 週間（または 2 回目の接種後 48 週間）で、ワクチンは炎症誘発性サイトカイン産生の増加を誘発します。自然免疫細胞。 フローサイトメトリー分析を使用して、ワクチン接種前およびワクチン接種後の単球の表現型と機能を特徴付けます。

完全に免疫があり、まだ臨床的なCovid 19感染を発症している人々がグループにまとめられ、免疫学的プロファイルが研究されます.