Bezpečnost a účinnost nereplikující se vektorové vakcíny ChAdOx1 AZD1222 (COVISHIELD), pro prevenci COVID-19 u pacientů s jaterní cirhózou

• Studijní populace: Skupina 1: Cirhóza jater Skupina 2: Kontrolní skupina (zdravé kontroly)
• Design studie: Jedno centrum, pilotní studie, adaptivní klinická studie
• Období studia: 1 rok, Období zápisu: březen 2021 až srpen 2021
• Velikost vzorku s odůvodněním:

Studie probíhá jako pilotní studie. Do obou skupin bude přihlášeno prvních 100 účastníků. Předběžná analýza však bude provedena po přihlášení 50 účastníků v každé skupině. Studie probíhá jako adaptivní klinická studie.

• Zásah:

  2 IM dávky (0,5 ml) AZD1222 (Covishield) v den 0 a po 6-8 týdnech první dávky (den 42-56 dní). Tento harmonogram bude dodržován pro prvních 100 účastníků, po jehož dodržení bude dodrženo očkovací schéma podle platných vládních protokolů jako součást adaptivní klinické studie.

• Sledování a hodnocení:

Hladiny IgG v séru SARS CoV2 a titry neutralizačních protilátek:

Vzorky krve na začátku (před první dávkou), 28. den (4 týdny/28 dní po první dávce a těsně před druhou dávkou), 8 týdnů (nebo 4 týdny po druhé dávce), 16 týdnů (nebo 12 týdnů po druhé dávce) 28 týdnů (nebo 24 týdnů po druhé dávce), 40 týdnů (nebo 36 týdnů po druhé dávce) a 52 týdnů (nebo 48 týdnů po druhé dávce) Po vakcinaci bude proveden screening na anti-SARS-CoV-2 IgG komerčně dostupnými chemiluminiscenční imunoanalýzy (CLIA) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA) na automatizovaném přístroji VITROS ECi/ECiQ/3600. Výsledky budou vyjádřeny jako reaktivní s poměrem sérum/cut off ≥ 1 a nereaktivní s poměrem < 1 S/Co.

Všechny reaktivní vzorky budou dále zpracovány, aby se změřil titr neutralizačních protilátek s využitím náhradního virového neutralizačního testu ELISA založeného na komerčním testu (sVNT) (GenScript cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit), aby se hledala odpověď neutralizačních protilátek na spike protein. viru.

Real Time PCR pro infekci SARS CoV-2:

Diagnóza infekce SARSCoV-2 bude potvrzena provedením reverzní transkriptázové polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RT-PCR) na kombinovaném nasofaryngeálním a ústním výtěru odebraném do virového transportního média a detekcí alespoň 2 specifických genových cílů SARS Virus CoV-2 (geny E a RdRP).

Primární IFN-y ELISPOT test. Vzorky krve na začátku (před první dávkou), 28. den (4 týdny/28 dní po první dávce a těsně před druhou dávkou), 8 týdnů (nebo 4 týdny po druhé dávce), 16 týdnů (nebo 12 týdnů po druhé dávce) 28 týdnů (nebo 24 týdnů po druhé dávce), 40 týdnů (nebo 36 týdnů po druhé dávce) a 52 týdnů (nebo 48 týdnů po druhé dávce). Primárně budou buněčné odezvy hodnoceny s použitím ex-vivo testu s enzymem vázaným na interferon-y (ELISpot) pro stanovení antigen-specifických T buněk. Stručně řečeno, PBMC budou izolovány z plné krve centrifugací s hustotním gradientem, okamžitě kryokonzervovány v 90% fetálním bovinním séru a 10% dimethylsulfoxidu a přeneseny do kapalného dusíku pro skladování.

Testy IFN-y ELISPOT budou provedeny za použití kryokonzervovaných PBMC. Stručně řečeno, nefrakcionované PBMC budou rozmraženy, resuspendovány v koncentraci 1 × 106 buněk/ml v médiu DMEM a budou umístěny v množství 100 μl/jamka (1 × 105 buněk/jamka) na 96jamkové destičky podložené nitrocelulózou ( Millipore Corp, Bedford, MA) předem potažené roztokem PBS monoklonální protilátky anti-IFN-y (1-D1K, 5 ug/ml; Mabtech Technologies, Nacka, Švédsko). Spolu s negativní kontrolou budou jako pozitivní kontroly použity různé buněčné stimuly (PMA; fytohemaglutinin 1 μg/ml a Ionomycin ). Destičky se poté inkubují při 37 °C po dobu 40 hodin a poté se sklidí a odečítají se na čtečce ELISPOT. Vakcínou indukovaná odpověď bude definována jako ≥3násobné zvýšení oproti základní linii odpovědi na individuální epitopový peptid.

Funkce T buněk:

Vzorky krve na začátku (před první dávkou), 28. den (4 týdny/28 dní po první dávce a těsně před druhou dávkou), 8 týdnů (nebo 4 týdny po druhé dávce), 16 týdnů (nebo 12 týdnů po druhé dávce) 28 týdnů (nebo 24 týdnů po druhé dávce), 40 týdnů (nebo 36 týdnů po druhé dávce) a 52 týdnů (nebo 48 týdnů po druhé dávce) Měření imunitní odpovědi bude hodnoceno pomocí periferních krevních mononukleárních buněk (PBMC) získaných vůbec časové body.

Pro zkoumání funkčnosti CD4 a CD8 T buněk budou PBMC kultivovány na 96jamkové destičce v médiu RPMI obsahujícím 10% FBS, s nebo bez PMA/ionomycinu (pozitivní kontrola) (PMA 2 ng/ml; ionomycin 1 μg/ml; Merck, Darmstadt, Německo) a 10 ug/ml LPS (Merck, Darmstadt, Německo) při 37 °C, 5 % C02 po dobu 6-7 hodin. Po 1 hodině inkubace se do všech jamek přidá 1 μg/ml brefeldinu A (BD Pharmingen, USA). Po inkubaci budou buňky povrchově barveny po dobu 25-30 minut anti-CD3FITC, anti-CD8BV421 a anti-CD4 PE/cyanin5.5 (Cy5) a následně 10 minut permeabilizace pomocí 100 ul permeabilizačního roztoku (BD Biosciences, USA) a promyje se dvakrát 500 ul 1x cytoperm. Po promytí budou buňky obarveny na intracelulární expresi IL-2, IFN-γ a IL-17 pomocí anti-IL2 APC, anti-IFN-γ PE, anti-IL-17 PE- Cy7 (BD Biosciences and Pharmingen, USA ) a budou inkubovány po dobu 25-30 minut s následným promytím PBS a fixací buněk v 0,1 % PFA před získáním na průtokovém cytometru BD Verse. Data budou analyzována pomocí softwaru FlowJo verze 10.

Přepínání monocytárního fenotypu a funkčnosti:

Vzorky krve na začátku (před první dávkou), 28. den (4 týdny/28 dní po první dávce a těsně před druhou dávkou), 8 týdnů (nebo 4 týdny po druhé dávce), 16 týdnů (nebo 12 týdnů po druhé dávce) 28 týdnů (nebo 24 týdnů po druhé dávce), 40 týdnů (nebo 36 týdnů po druhé dávce) a 52 týdnů (nebo 48 týdnů po druhé dávce) Vakcína vyvolá zvýšení produkce prozánětlivých cytokinů, které je závislé na trénované imunitě vrozené imunitní buňky. Pomocí průtokové cytometrické analýzy budeme charakterizovat fenotyp a funkčnost monocytů před vakcinací a po vakcinaci.

Ti, kteří jsou plně imunizováni a stále se rozvíjející klinická infekce Covid 19, budou seskupeni a bude studován imunologický profil.