Segurança e eficácia de uma vacina de vetor ChAdOx1 não replicante AZD1222 (COVISHIELD), para prevenção de COVID-19 em pacientes com cirrose hepática

• População do estudo: Grupo 1: Cirrose Hepática Grupo 2: Grupo Controle (Controles saudáveis)
• Desenho do estudo: Um Centro Único, Estudo Piloto, Ensaio Clínico Adaptativo
• Período de estudo: 1 ano, período de inscrição: março de 2021 a agosto de 2021
• Tamanho da amostra com justificativa:

O estudo está sendo conduzido como um estudo piloto. Os primeiros 100 participantes serão inscritos em ambos os grupos. No entanto, uma análise preliminar será feita após a inscrição de 50 participantes em cada grupo. O estudo está sendo conduzido como um ensaio clínico adaptativo.

• Intervenção:

  2 doses IM (0,5 mL) de AZD1222 (Covishield) no dia 0 e após 6-8 semanas da primeira dose (dia 42-56 dias). Este cronograma será seguido para os primeiros 100 participantes, após o qual o cronograma de vacinação de acordo com os protocolos governamentais vigentes será seguido como parte do Ensaio Clínico Adaptativo.

• Monitoramento e avaliação:

Níveis de IgG no soro de SARS CoV2 e títulos de anticorpos neutralizantes:

As amostras de sangue no início do estudo (antes da primeira dose), dia 28 (4 semanas/28 dias após a primeira dose e imediatamente antes da segunda dose), 8 semanas (ou 4 semanas após a segunda dose), 16 semanas (ou 12 semanas após a segunda dose) , 28 semanas (ou 24 semanas após a segunda dose), 40 semanas (ou 36 semanas após a segunda dose) e 52 semanas (ou 48 semanas após a segunda dose). imunoensaios quimioluminescentes (CLIA) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, EUA) no instrumento automatizado VITROS ECi/ECiQ/3600. Os resultados serão expressos como reativos com relação soro/corte ≥ 1 e não reativos com relação S/Co < 1.

Todas as amostras reativas serão processadas posteriormente para medir o título de anticorpo neutralizante utilizando um teste de neutralização de vírus substituto ELISA baseado em ensaio comercial (sVNT) (GenScript cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit) para procurar resposta de anticorpo neutralizante à proteína spike do vírus.

PCR em tempo real para infecção por SARS CoV-2:

Um diagnóstico de infecção por SARSCoV-2 será confirmado pelo desempenho da reação em cadeia da polimerase da transcriptase reversa em tempo real (RT-PCR) no swab nasofaríngeo e oral combinado coletado no meio de transporte viral e pela detecção de pelo menos 2 alvos genéticos específicos do SARS Vírus CoV-2 (genes E e RdRP).

Ensaio primário IFN-γ ELISPOT. As amostras de sangue no início do estudo (antes da primeira dose), dia 28 (4 semanas/28 dias após a primeira dose e imediatamente antes da segunda dose), 8 semanas (ou 4 semanas após a segunda dose), 16 semanas (ou 12 semanas após a segunda dose) , 28 semanas (ou 24 semanas após a segunda dose), 40 semanas (ou 36 semanas após a segunda dose) e 52 semanas (ou 48 semanas após a segunda dose). Primeiramente, as respostas celulares serão avaliadas usando um ensaio ex-vivo interferon-γ ligado a enzima imunospot (ELISpot) para enumerar células T específicas do antígeno. Resumidamente, PBMCs serão isoladas do sangue total por centrifugação em gradiente de densidade, imediatamente criopreservadas em 90% de soro fetal bovino e 10% de dimetil sulfóxido, e transferidas para nitrogênio líquido para armazenamento.

Os ensaios de IFN-γ ELISPOT serão realizados usando PBMC criopreservados. Resumidamente, as PBMC não fracionadas serão descongeladas, ressuspensas a uma concentração de 1 × 106 células/ml em meio DMEM e serão semeadas a 100 μl/poço (1 × 105 células/poço) em placas de 96 poços revestidas com nitrocelulose ( Millipore Corp, Bedford, MA) previamente revestido com uma solução PBS de anticorpo monoclonal anti-IFN-γ (1-D1K, 5 μg/ml; Mabtech Technologies, Nacka, Suécia). Junto com o controle negativo, diferentes estímulos celulares (PMA; fitohemaglutinina 1 μg/ml e Ionomicina) serão usados ​​como controles positivos., As placas serão então incubadas a 37°C por 40 h, e então serão colhidas e lidas no leitor ELISPOT. Uma resposta induzida por vacina será definida como um aumento ≥3 vezes em relação à resposta de linha de base ao peptídeo epítopo individual.

Células T Funcionalidade:

As amostras de sangue no início do estudo (antes da primeira dose), dia 28 (4 semanas/28 dias após a primeira dose e imediatamente antes da segunda dose), 8 semanas (ou 4 semanas após a segunda dose), 16 semanas (ou 12 semanas após a segunda dose) , 28 semanas (ou 24 semanas após a segunda dose), 40 semanas (ou 36 semanas após a segunda dose) e 52 semanas (ou 48 semanas após a segunda dose) As medições da resposta imune serão avaliadas usando células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas em todos Pontos de tempo.

Para investigar a funcionalidade das células T CD4 e CD8, as PBMCs serão cultivadas em placas de 96 poços em meio RPMI contendo 10% FBS, com ou sem PMA/Ionomicina (controle positivo) (PMA 2 ng/mL; ionomicina 1 μg/mL; Merck, Darmstadt, Alemanha) e 10 µg/ml de LPS (Merck, Darmstadt, Alemanha) a 37°C, 5% de CO2 por 6-7 horas. Após 1 hora de incubação, 1 μg/mL de brefeldina A (BD Pharmingen, EUA) será adicionado a todos os poços. Após a incubação, as células serão coradas na superfície por 25-30 minutos com anti-CD3FITC, anti-CD8BV421 e anti-CD4 PE/cyanine5.5 (Cy5) seguido de 10 minutos de permeabilização com 100 µL de solução permeabilizante (BD Biosciences, EUA) e serão lavadas duas vezes com 500 µL 1x cytoperm. Após a lavagem, as células serão coradas para expressão intracelular de IL-2, IFN-γ e IL-17 com anti-IL2 APC, anti-IFN-γ PE, anti-IL-17 PE- Cy7 (BD Biosciences and Pharmingen, EUA ) e serão incubadas por 25-30 minutos, seguidas de lavagem com PBS e fixação das células em 0,1% de PFA antes da aquisição em um citômetro de fluxo BD Verse. Os dados serão analisados ​​usando o software FlowJo versão 10.

Mudança de fenótipo e funcionalidade de monócitos:

As amostras de sangue no início do estudo (antes da primeira dose), dia 28 (4 semanas/28 dias após a primeira dose e imediatamente antes da segunda dose), 8 semanas (ou 4 semanas após a segunda dose), 16 semanas (ou 12 semanas após a segunda dose) , 28 semanas (ou 24 semanas após a segunda dose), 40 semanas (ou 36 semanas após a segunda dose) e 52 semanas (ou 48 semanas após a segunda dose) A vacina induzirá um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias, que depende da imunidade treinada em células imunes inatas. Iremos caracterizar o fenótipo e a funcionalidade dos monócitos antes e após a vacinação por meio de análise de citometria de fluxo.

Aqueles que estiverem totalmente imunizados e ainda desenvolverem infecção clínica por Covid 19 serão agrupados e o perfil imunológico será estudado.