간경변 환자의 COVID-19 예방을 위한 비복제 ChAdOx1 벡터 백신 AZD1222(COVISHIELD)의 안전성 및 효능

• 연구 모집단: 그룹 1: 간경변증 그룹 2: 대조군(건강한 대조군)
• 연구 설계: 단일 센터, 예비 연구, 적응형 임상 시험
• 학습 기간: 1년, 등록 기간: 2021년 3월 ~ 2021년 8월
• 근거가 있는 샘플 크기:

연구는 파일럿 연구로 수행되고 있습니다. 선착순 100명의 참가자가 두 그룹 모두에 등록됩니다. 그러나 예비 분석은 각 그룹에 50명의 참가자를 등록한 후에 수행됩니다. 연구는 적응형 임상 시험으로 진행되고 있습니다.

• 간섭:

  AZD1222(Covishield)의 2 IM 용량(0.5mL)을 0일 및 첫 번째 용량의 6-8주 후(42-56일)에 투여합니다. 이 일정은 처음 100명의 참가자에 대해 따를 것이며, 적응형 임상 시험의 일부로 지배적인 정부 프로토콜에 따른 백신 접종 일정을 따라야 합니다.

• 모니터링 및 평가:

SARS CoV2 혈청 IgG 수준 및 중화 항체 역가:

기준선(첫 번째 투여 전), 28일(첫 번째 투여 후 4주/28일 및 두 번째 투여 직전), 8주(또는 두 번째 투여 후 4주), 16주(또는 두 번째 투여 후 12주)의 혈액 샘플 , 28주(또는 2차 접종 후 24주), 40주(또는 2차 접종 후 36주) 및 52주(또는 2차 접종 후 48주) 백신 접종 후 시판되는 항-SARS-CoV-2 IgG에 대해 스크리닝합니다. VITROS ECi/ECiQ/3600 자동화 기기에서 화학발광 면역분석(CLIA) SARS-CoV-2 IgG(Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA). 결과는 Serum/cut off ratio ≥ 1인 경우 반응성으로, S/Co 비율이 1 미만인 경우 비반응성으로 표시됩니다.

모든 반응성 샘플은 스파이크 단백질에 대한 중화 항체 반응을 찾기 위해 대리 바이러스 중화 테스트 ELISA 기반 상용 분석(sVNT)(GenScript cPass™ SARS-CoV-2 중화 항체 검출 키트)을 사용하여 중화 항체 역가를 측정하기 위해 추가 처리됩니다. 바이러스의.

SARS CoV-2 감염에 대한 실시간 PCR:

SARSCoV-2 감염의 진단은 Viral transport medium에서 수집된 비인두 및 구강 결합 면봉에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 수행과 SARS의 최소 2개의 특정 유전자 표적 검출에 의해 확인됩니다. CoV-2 바이러스(E 및 RdRP 유전자).

1차 IFN-γ ELISPOT 분석. 기준선(첫 번째 투여 전), 28일(첫 번째 투여 후 4주/28일 및 두 번째 투여 직전), 8주(또는 두 번째 투여 후 4주), 16주(또는 두 번째 투여 후 12주)의 혈액 샘플 , 28주(또는 2차 투여 후 24주), 40주(또는 2차 투여 후 36주) 및 52주(또는 2차 투여 후 48주)를 수집할 것이다. 주로 세포 반응은 항원 특이적 T 세포를 열거하기 위해 생체 외 인터페론-γ 효소 연결 면역스팟(ELISpot) 분석을 사용하여 평가됩니다. 간단히 말해서, PBMC는 밀도 구배 원심분리에 의해 전혈로부터 분리되고, 즉시 90% 태아 소 혈청 및 10% 디메틸 설폭사이드에서 동결 보존되고, 저장을 위해 액체 질소로 옮겨질 것입니다.

IFN-γ ELISPOT 분석은 동결보존된 PBMC를 사용하여 수행됩니다. 간단히 말해서, 미분획 PBMC를 해동하고 DMEM 배지에 1 x 106개 세포/ml의 농도로 재현탁하고 96-웰, 니트로셀룰로스 기반 플레이트에 100 μl/웰(1 x 105개 세포/웰)로 플레이팅합니다. Millipore Corp, Bedford, MA)는 이전에 항-IFN-γ 단클론 항체(1-D1K, 5μg/ml; Mabtech Technologies, Nacka, Sweden)의 PBS 용액으로 코팅되었습니다. 음성 대조군과 함께, 상이한 세포 자극(PMA; 피토헤마글루티닌 1㎍/ml 및 이오노마이신)이 양성 대조군으로 사용될 것이다., 그런 다음 플레이트를 37°C에서 40시간 동안 배양한 다음 수확하고 ELISPOT 판독기에서 읽습니다. 백신 유발 반응은 개별 에피토프 펩타이드에 대한 기준선 반응보다 ≥3배 증가한 것으로 정의됩니다.

T 세포 기능:

기준선(첫 번째 투여 전), 28일(첫 번째 투여 후 4주/28일 및 두 번째 투여 직전), 8주(또는 두 번째 투여 후 4주), 16주(또는 두 번째 투여 후 12주)의 혈액 샘플 , 28주(또는 2차 투여 후 24주), 40주(또는 2차 투여 후 36주) 및 52주(또는 2차 투여 후 48주) 면역 반응 측정은 전혀 얻은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 평가됩니다. 시점.

CD4 및 CD8 T 세포 기능을 조사하기 위해 PBMC는 PMA/Ionomycin(양성 대조군)(PMA 2 ng/mL; ionomycin 1 μg/mL; Merck, Darmstadt, Germany) 및 10㎍/ml LPS(Merck, Darmstadt, Germany)를 37℃, 5% CO2에서 6-7시간 동안. 1시간 배양 후, 1 μg/mL 브레펠딘 A(BD Pharmingen, USA)를 모든 웰에 첨가할 것입니다. 배양 후, 세포는 항-CD3FITC, 항-CD8BV421 및 항-CD4 PE/시아닌5.5(Cy5)로 25-30분 동안 표면 염색되고 이어서 100μL의 투과성 용액(BD Biosciences, USA)으로 10분 동안 투과됩니다. 그리고 500 µL 1x cytoperm으로 두 번 세척됩니다. 세척 후 세포는 항-IL2 APC, 항-IFN-γ PE, 항-IL-17 PE-Cy7(BD Biosciences and Pharmingen, USA)로 IL-2, IFN-γ 및 IL-17의 세포내 발현에 대해 염색됩니다. ) 25-30분 동안 인큐베이션한 후 PBS로 세척하고 세포를 0.1% PFA에 고정한 후 BD Verse 유세포 분석기에서 수집합니다. FlowJo 소프트웨어 버전 10을 사용하여 데이터를 분석합니다.

단핵구 표현형 및 기능의 전환:

기준선(첫 번째 투여 전), 28일(첫 번째 투여 후 4주/28일 및 두 번째 투여 직전), 8주(또는 두 번째 투여 후 4주), 16주(또는 두 번째 투여 후 12주)의 혈액 샘플 , 28주(또는 2차 접종 후 24주), 40주(또는 2차 접종 후 36주) 및 52주(또는 2차 접종 후 48주) 백신은 전염증성 사이토카인 생산의 증가를 유도할 것이며, 이는 훈련된 면역에 의존합니다. 선천면역세포. 유세포 분석을 사용하여 백신 접종 전과 백신 접종 후 단핵구의 표현형과 기능을 특성화할 것입니다.

완전히 예방 접종을 받았고 여전히 임상 Covid 19 감염이 진행 중인 사람들은 함께 그룹화되고 면역학적 프로필이 연구될 것입니다.