Sicurezza ed efficacia di un vaccino vettoriale ChAdOx1 non replicante AZD1222 (COVISHIELD), per la prevenzione di COVID-19 in pazienti con cirrosi epatica

• Popolazione in studio: Gruppo 1: cirrosi epatica Gruppo 2: gruppo di controllo (controlli sani)
• Disegno dello studio: un centro unico, studio pilota, sperimentazione clinica adattiva
• Periodo di studio: 1 anno, Periodo di iscrizione: da marzo 2021 ad agosto 2021
• Dimensione del campione con giustificazione:

Lo studio è in corso come studio pilota. I primi 100 partecipanti saranno iscritti a entrambi i gruppi. Tuttavia, un'analisi preliminare verrà effettuata dopo l'arruolamento di 50 partecipanti in ciascun gruppo. Lo studio è stato condotto come sperimentazione clinica adattiva.

• Intervento:

  2 dosi IM (0,5 ml) di AZD1222 (Covishield) al giorno 0 e dopo 6-8 settimane dalla prima dose (giorni 42-56). Questo programma sarà seguito per i primi 100 partecipanti, dopodiché sarà seguito il programma di vaccinazione secondo i protocolli governativi prevalenti come parte della sperimentazione clinica adattiva.

• Monitoraggio e valutazione:

Livelli sierici di IgG SARS CoV2 e titoli anticorpali neutralizzanti:

I campioni di sangue al basale (prima della prima dose), giorno 28 (4 settimane/28 giorni dopo la prima dose e appena prima della seconda dose), 8 settimane (o 4 settimane dopo la seconda dose), 16 settimane (o 12 settimane dopo la seconda dose) , 28 settimane (o 24 settimane dopo la seconda dose), 40 settimane (o 36 settimane dopo la seconda dose) e 52 settimane (o 48 settimane dopo la seconda dose). test immunologici a chemiluminescenza (CLIA) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA) sullo strumento automatizzato VITROS ECi/ECiQ/3600. I risultati saranno espressi come reattivi con rapporto siero/cut off ≥ 1 e non reattivi con rapporto S/Co < 1.

Tutti i campioni reattivi verranno ulteriormente elaborati per misurare il titolo dell'anticorpo neutralizzante utilizzando un test commerciale surrogato di neutralizzazione del virus basato su ELISA (sVNT) (GenScript cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit) per cercare la risposta dell'anticorpo neutralizzante alla proteina spike del virus.

PCR in tempo reale per l'infezione da SARS CoV-2:

Una diagnosi di infezione da SARSCoV-2 sarà confermata dall'esecuzione della reazione a catena della polimerasi della trascrittasi inversa in tempo reale (RT-PCR) sul tampone nasofaringeo e orale combinato raccolto nel mezzo di trasporto virale e dal rilevamento di almeno 2 bersagli genici specifici della SARS Virus CoV-2 (geni E e RdRP).

Saggio primario IFN-γ ELISPOT. I campioni di sangue al basale (prima della prima dose), giorno 28 (4 settimane/28 giorni dopo la prima dose e appena prima della seconda dose), 8 settimane (o 4 settimane dopo la seconda dose), 16 settimane (o 12 settimane dopo la seconda dose) , 28 settimane (o 24 settimane dopo la seconda dose), 40 settimane (o 36 settimane dopo la seconda dose) e 52 settimane (o 48 settimane dopo la seconda dose). In primo luogo, le risposte cellulari saranno valutate utilizzando un saggio immunospot legato all'enzima interferone-γ ex-vivo (ELISpot) per enumerare le cellule T antigene-specifiche. In breve, le PBMC saranno isolate dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente di densità, immediatamente crioconservate in 90% siero bovino fetale e 10% dimetilsolfossido, e trasferite in azoto liquido per la conservazione.

I saggi ELISPOT di IFN-γ saranno eseguiti utilizzando PBMC crioconservate. In breve, le PBMC non frazionate saranno scongelate, risospese ad una concentrazione di 1 × 106 cellule/ml in terreno DMEM, e saranno piastrate a 100 μl/pozzetto (1 × 105 cellule/pozzetto) in piastre da 96 pozzetti, supportate da nitrocellulosa ( Millipore Corp, Bedford, MA) precedentemente rivestito con una soluzione PBS di anticorpo monoclonale anti-IFN-γ (1-D1K, 5 μg/ml; Mabtech Technologies, Nacka, Svezia). Insieme al controllo negativo, come controlli positivi verranno utilizzati diversi stimoli cellulari (PMA; fitoemoagglutinina 1 μg/ml e ionomicina)., Le piastre verranno quindi incubate a 37°C per 40 ore, quindi raccolte e lette nel lettore ELISPOT. Una risposta indotta dal vaccino sarà definita come un aumento ≥3 volte rispetto alla risposta basale al singolo peptide epitopo.

Funzionalità delle cellule T:

I campioni di sangue al basale (prima della prima dose), giorno 28 (4 settimane/28 giorni dopo la prima dose e appena prima della seconda dose), 8 settimane (o 4 settimane dopo la seconda dose), 16 settimane (o 12 settimane dopo la seconda dose) , 28 settimane (o 24 settimane dopo la seconda dose), 40 settimane (o 36 settimane dopo la seconda dose) e 52 settimane (o 48 settimane dopo la seconda dose) Le misurazioni della risposta immunitaria saranno valutate utilizzando cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenute a tutti punti temporali.

Per studiare la funzionalità delle cellule T CD4 e CD8, le PBMC saranno coltivate in piastre da 96 pozzetti in terreno RPMI contenente il 10% di FBS, con o senza PMA / Ionomicina (controllo positivo) (PMA 2 ng/mL; ionomicina 1 μg/mL; Merck, Darmstadt, Germania) e 10 µg /ml LPS (Merck, Darmstadt, Germania) a 37°C,5% CO2 per 6-7 ore. Dopo 1 ora di incubazione, 1 μg/mL di brefeldin A (BD Pharmingen, USA) verrà aggiunto a tutti i pozzetti. Dopo l'incubazione, le cellule saranno colorate in superficie per 25-30 minuti con anti-CD3FITC, anti-CD8BV421 e anti-CD4 PE/cianina5.5 (Cy5) seguite da 10 minuti di permeabilizzazione con 100 µL di soluzione permeabilizzante (BD Biosciences, USA) e saranno lavati due volte con 500 µL 1x cytoperm. Dopo il lavaggio, le cellule saranno colorate per l'espressione intracellulare di IL-2, IFN-γ e IL-17 con anti-IL2 APC, anti-IFN-γ PE, anti-IL-17 PE-Cy7 (BD Biosciences and Pharmingen, USA ) e saranno incubate per 25-30 minuti seguite da lavaggio con PBS e fissaggio delle cellule in PFA allo 0,1% prima dell'acquisizione su un citometro a flusso BD Verse. I dati saranno analizzati utilizzando il software FlowJo versione 10.

Commutazione del fenotipo e della funzionalità dei monociti:

I campioni di sangue al basale (prima della prima dose), giorno 28 (4 settimane/28 giorni dopo la prima dose e appena prima della seconda dose), 8 settimane (o 4 settimane dopo la seconda dose), 16 settimane (o 12 settimane dopo la seconda dose) , 28 settimane (o 24 settimane dopo la seconda dose), 40 settimane (o 36 settimane dopo la seconda dose) e 52 settimane (o 48 settimane dopo la seconda dose) Il vaccino indurrà un aumento della produzione di citochine proinfiammatorie, che dipende dall'immunità allenata in cellule immunitarie innate. Caratterizzeremo il fenotipo e la funzionalità dei monociti prima della vaccinazione e dopo la vaccinazione utilizzando l'analisi citometrica a flusso.

Coloro che sono completamente immunizzati e stanno ancora sviluppando un'infezione clinica da Covid 19 saranno raggruppati e sarà studiato il profilo immunologico.