Seguridad y eficacia de una vacuna AZD1222 del vector ChAdOx1 no replicante (COVISHIELD), para la prevención de la COVID-19 en pacientes con cirrosis hepática

• Población de estudio: Grupo 1: Cirrosis hepática Grupo 2: Grupo de control (Controles sanos)
• Diseño del estudio: Un solo centro, estudio piloto, ensayo clínico adaptativo
• Período de estudio: 1 año, Período de inscripción: de marzo de 2021 a agosto de 2021
• Tamaño de la muestra con justificación:

El estudio se está realizando como un estudio piloto. Los primeros 100 participantes se inscribirán en ambos grupos. Sin embargo, se realizará un análisis preliminar después de la inscripción de 50 participantes en cada grupo. El estudio se está realizando como un ensayo clínico adaptativo.

• Intervención:

  2 dosis IM (0,5 ml) de AZD1222 (Covishield) en el día 0 y después de 6 a 8 semanas de la primera dosis (días 42 a 56). Este calendario se seguirá para los primeros 100 participantes, después de lo cual se seguirá el calendario de vacunación según los protocolos gubernamentales vigentes como parte del Ensayo Clínico Adaptativo.

• Seguimiento y evaluación:

Niveles de IgG en suero de SARS CoV2 y títulos de anticuerpos neutralizantes:

Las muestras de sangre al inicio (antes de la primera dosis), el día 28 (4 semanas/28 días después de la primera dosis y justo antes de la segunda dosis), 8 semanas (o 4 semanas después de la segunda dosis), 16 semanas (o 12 semanas después de la segunda dosis) , 28 semanas (o 24 semanas después de la segunda dosis), 40 semanas (o 36 semanas después de la segunda dosis) y 52 semanas (o 48 semanas después de la segunda dosis) Después de la vacunación, se realizarán pruebas de detección de IgG anti-SARS-CoV-2 mediante inmunoensayos quimioluminiscentes (CLIA) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, EE. UU.) en el instrumento automatizado VITROS ECi/ECiQ/3600. Los resultados se expresarán como reactivos con una relación suero/punto de corte ≥ 1 y no reactivos con una relación S/Co < 1.

Todas las muestras reactivas se procesarán adicionalmente para medir el título de anticuerpos neutralizantes utilizando un ensayo comercial basado en ELISA de prueba de neutralización de virus sustituto (sVNT) (Kit de detección de anticuerpos de neutralización GenScript cPass™ SARS-CoV-2) para buscar una respuesta de anticuerpos neutralizantes a la proteína de pico del virus.

PCR en tiempo real para la infección por SARS CoV-2:

Un diagnóstico de infección por SARSCoV-2 se confirmará mediante la realización de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real (RT-PCR) en el hisopo nasofaríngeo y oral combinado recolectado en un medio de transporte viral y mediante la detección de al menos 2 objetivos genéticos específicos del SARS Virus CoV-2 (genes E y RdRP).

Ensayo ELISPOT de IFN-γ primario. Las muestras de sangre al inicio (antes de la primera dosis), el día 28 (4 semanas/28 días después de la primera dosis y justo antes de la segunda dosis), 8 semanas (o 4 semanas después de la segunda dosis), 16 semanas (o 12 semanas después de la segunda dosis) , 28 semanas (o 24 semanas después de la segunda dosis), 40 semanas (o 36 semanas después de la segunda dosis) y 52 semanas (o 48 semanas después de la segunda dosis). Principalmente, las respuestas celulares se evaluarán mediante un ensayo de inmunospot ligado a enzimas (ELISpot) de interferón-γ ex vivo para enumerar las células T específicas de antígeno. En resumen, las PBMC se aislarán de la sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad, se crioconservarán inmediatamente en suero bovino fetal al 90 % y sulfóxido de dimetilo al 10 %, y se transferirán a nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Los ensayos ELISPOT de IFN-γ se realizarán utilizando PBMC crioconservadas. Brevemente, las PBMC no fraccionadas se descongelarán, se resuspenderán a una concentración de 1 × 106 células/ml en medio DMEM y se sembrarán en placas a 100 μl/pocillo (1 × 105 células/pocillo) en placas de 96 pocillos con respaldo de nitrocelulosa ( Millipore Corp, Bedford, MA) previamente recubierta con una solución de PBS de anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ (1-D1K, 5 μg/ml; Mabtech Technologies, Nacka, Suecia). Junto con el control negativo, se utilizarán como controles positivos diferentes estímulos celulares (PMA; fitohemaglutinina 1 μg/ml e ionomicina). Luego, las placas se incubarán a 37 °C durante 40 h y luego se recolectarán y leerán en el lector ELISPOT. Una respuesta inducida por la vacuna se definirá como un aumento de ≥3 veces sobre la respuesta inicial al péptido del epítopo individual.

Funcionalidad de las células T:

Las muestras de sangre al inicio (antes de la primera dosis), el día 28 (4 semanas/28 días después de la primera dosis y justo antes de la segunda dosis), 8 semanas (o 4 semanas después de la segunda dosis), 16 semanas (o 12 semanas después de la segunda dosis) , 28 semanas (o 24 semanas después de la segunda dosis), 40 semanas (o 36 semanas después de la segunda dosis) y 52 semanas (o 48 semanas después de la segunda dosis) Las mediciones de la respuesta inmunitaria se evaluarán utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas en todos puntos de tiempo.

Para investigar la funcionalidad de las células T CD4 y CD8, las PBMC se cultivarán en una placa de 96 pocillos en medios RPMI que contienen FBS al 10 %, con o sin PMA/ionomicina (control positivo) (PMA 2 ng/ml; ionomicina 1 μg/ml; Merck, Darmstadt, Alemania) y 10 µg/ml LPS (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37°C, 5% CO2 durante 6-7 horas. Después de 1 hora de incubación, se añadirá a todos los pocillos 1 μg/mL de brefeldina A (BD Pharmingen, EE. UU.). Después de la incubación, la superficie de las células se tiñerá durante 25-30 minutos con anti-CD3FITC, anti-CD8BV421 y anti-CD4 PE/cianina5.5 (Cy5) seguido de 10 minutos de permeabilización con 100 µL de solución permeabilizante (BD Biosciences, EE. UU.) y se lavará dos veces con 500 µL 1x cytoperm. Después del lavado, las células se tiñerán para determinar la expresión intracelular de IL-2, IFN-γ e IL-17 con anti-IL2 APC, anti-IFN-γ PE, anti-IL-17 PE-Cy7 (BD Biosciences and Pharmingen, EE. UU. ) y se incubarán durante 25-30 minutos, luego se lavarán con PBS y se fijarán las células en PFA al 0,1 % antes de adquirirlas en un citómetro de flujo BD Verse. Los datos se analizarán utilizando el software FlowJo versión 10.

Cambio de monocitos Fenotipo y funcionalidad:

Las muestras de sangre al inicio (antes de la primera dosis), el día 28 (4 semanas/28 días después de la primera dosis y justo antes de la segunda dosis), 8 semanas (o 4 semanas después de la segunda dosis), 16 semanas (o 12 semanas después de la segunda dosis) , 28 semanas (o 24 semanas después de la segunda dosis), 40 semanas (o 36 semanas después de la segunda dosis) y 52 semanas (o 48 semanas después de la segunda dosis) La vacuna inducirá un aumento en la producción de citocinas proinflamatorias, que depende de la inmunidad entrenada en células inmunitarias innatas. Caracterizaremos el fenotipo y la funcionalidad de los monocitos antes y después de la vacunación mediante análisis de citometría de flujo.

Aquellos que estén completamente inmunizados y aún desarrollen una infección clínica por Covid 19 se agruparán y se estudiará el perfil inmunológico.