Bezpieczeństwo i skuteczność niereplikującej się szczepionki wektorowej ChAdOx1 AZD1222 (COVISHIELD) w zapobieganiu COVID-19 u pacjentów z marskością wątroby

• Badana populacja: Grupa 1: Marskość wątroby Grupa 2: Grupa kontrolna (zdrowe grupy kontrolne)
• Projekt badania: pojedynczy ośrodek, badanie pilotażowe, adaptacyjne badanie kliniczne
• Okres studiów: 1 rok, Okres zapisów: marzec 2021 do sierpnia 2021
• Wielkość próbki z uzasadnieniem:

Badanie jest prowadzone jako badanie pilotażowe. Do obu grup zapisanych zostanie pierwszych 100 uczestników. Jednak wstępna analiza zostanie przeprowadzona po zapisaniu 50 uczestników do każdej grupy. Badanie jest prowadzone jako adaptacyjne badanie kliniczne.

• Interwencja:

  2 dawki IM (0,5 ml) AZD1222 (Covishield) w dniu 0 i po 6-8 tygodniach pierwszej dawki (dzień 42-56 dni). Harmonogram ten będzie przestrzegany dla pierwszych 100 uczestników, po których harmonogram szczepień zgodnie z obowiązującymi protokołami rządowymi będzie przestrzegany w ramach Adaptacyjnego Badania Klinicznego.

• Monitorowanie i ocena:

SARS CoV2 surowicze IgG Poziomy i miana przeciwciał neutralizujących:

Próbki krwi na początku badania (przed pierwszą dawką), 28. dnia (4 tygodnie/28 dni po pierwszej dawce i tuż przed drugą dawką), 8 tygodni (lub 4 tygodnie po drugiej dawce), 16 tygodni (lub 12 tygodni po drugiej dawce) , 28 tygodni (lub 24 tygodnie po drugiej dawce), 40 tygodni (lub 36 tygodni po drugiej dawce) i 52 tygodnie (lub 48 tygodni po drugiej dawce) chemiluminescencyjne testy immunologiczne (CLIA) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA) na automatycznym aparacie VITROS ECi/ECiQ/3600. Wyniki zostaną wyrażone jako reaktywne ze stosunkiem surowica/odcięcie ≥ 1 i niereaktywne ze stosunkiem S/Co < 1.

Wszystkie próbki reaktywne będą dalej przetwarzane w celu zmierzenia miana przeciwciał neutralizujących z wykorzystaniem testu neutralizacji zastępczego wirusa opartego na komercyjnym teście ELISA (sVNT) (GenScript cPass™ SARS-CoV-2 Neutralizacja przeciwciała wykrywającego zestaw) w celu wyszukania odpowiedzi przeciwciał neutralizujących na białko szczytowe od wirusa.

PCR w czasie rzeczywistym w kierunku zakażenia SARS CoV-2:

Rozpoznanie zakażenia SARSCoV-2 zostanie potwierdzone przez wykonanie reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR) na połączonym wymazie z jamy nosowo-gardłowej i jamy ustnej pobranym w wirusowym podłożu transportowym oraz przez wykrycie co najmniej 2 specyficznych genów docelowych SARS Wirus CoV-2 (geny E i RdRP).

Podstawowy test IFN-γ ELISPOT. Próbki krwi na początku badania (przed pierwszą dawką), 28. dnia (4 tygodnie/28 dni po pierwszej dawce i tuż przed drugą dawką), 8 tygodni (lub 4 tygodnie po drugiej dawce), 16 tygodni (lub 12 tygodni po drugiej dawce) , 28 tygodni (lub 24 tygodnie po drugiej dawce), 40 tygodni (lub 36 tygodni po drugiej dawce) i 52 tygodnie (lub 48 tygodni po drugiej dawce). Przede wszystkim odpowiedzi komórkowe zostaną ocenione przy użyciu testu immunospot połączonego z interferonem γ ex vivo (ELISpot) w celu zliczenia limfocytów T swoistych dla antygenu. W skrócie, PBMC zostaną wyizolowane z pełnej krwi przez wirowanie w gradiencie gęstości, natychmiast poddane kriokonserwacji w 90% płodowej surowicy bydlęcej i 10% sulfotlenku dimetylu i przeniesione do ciekłego azotu w celu przechowywania.

Testy IFN-γ ELISPOT zostaną przeprowadzone przy użyciu kriokonserwowanych PBMC. W skrócie, niefrakcjonowane PBMC zostaną rozmrożone, ponownie zawieszone w stężeniu 1 × 106 komórek/ml w pożywce DMEM i zostaną wysiane w ilości 100 µl/studzienkę (1 × 105 komórek/studzienkę) w 96-studzienkowych płytkach z podkładem nitrocelulozowym ( Millipore Corp, Bedford, MA) uprzednio opłaszczone roztworem PBS przeciwciała monoklonalnego anty-IFN-γ (1-D1K, 5 μg/ml; Mabtech Technologies, Nacka, Szwecja). Oprócz kontroli negatywnej jako kontroli pozytywnej zostaną użyte różne bodźce komórkowe (PMA; fitohemaglutynina 1 μg/ml i jonomycyna). Płytki będą następnie inkubowane w temperaturze 37°C przez 40 godzin, a następnie zostaną zebrane i odczytane w czytniku ELISPOT. Odpowiedź wywołana szczepionką będzie zdefiniowana jako ≥3-krotny wzrost w stosunku do odpowiedzi wyjściowej na pojedynczy peptyd epitopowy.

Komórki T Funkcjonalność:

Próbki krwi na początku badania (przed pierwszą dawką), 28. dnia (4 tygodnie/28 dni po pierwszej dawce i tuż przed drugą dawką), 8 tygodni (lub 4 tygodnie po drugiej dawce), 16 tygodni (lub 12 tygodni po drugiej dawce) , 28 tygodni (lub 24 tygodnie po drugiej dawce), 40 tygodni (lub 36 tygodni po drugiej dawce) i 52 tygodnie (lub 48 tygodni po drugiej dawce) Pomiary odpowiedzi immunologicznej będą oceniane przy użyciu jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) uzyskanych w punkty czasowe.

Aby zbadać funkcjonalność komórek T CD4 i CD8, PBMC będą hodowane w 96-dołkowej płytce w pożywce RPMI zawierającej 10% FBS, z lub bez PMA / jonomycyny (kontrola pozytywna) (PMA 2 ng/ml; jonomycyna 1 μg/ml; Merck, Darmstadt, Niemcy) i 10 ug/ml LPS (Merck, Darmstadt, Niemcy) w 37°C, 5% CO2 przez 6-7 godzin. Po 1 godzinie inkubacji do wszystkich dołków zostanie dodany 1 μg/ml brefeldyny A (BD Pharmingen, USA). Po inkubacji komórki będą barwione powierzchniowo przez 25-30 minut anty-CD3FITC, anty-CD8BV421 i anty-CD4 PE/cyjanina5.5 (Cy5), a następnie 10 minut permeabilizacji 100 µl roztworu permeabilizującego (BD Biosciences, USA) i zostanie dwukrotnie przemyty 500 µl 1x cytopermu. Po przepłukaniu komórki będą barwione pod kątem wewnątrzkomórkowej ekspresji IL-2, IFN-γ i IL-17 anty-IL2 APC, anty-IFN-γ PE, anty-IL-17 PE-Cy7 (BD Biosciences and Pharmingen, USA ) i będą inkubowane przez 25-30 minut, a następnie przemywane PBS i utrwalane w 0,1% PFA przed akwizycją na cytometrze przepływowym BD Verse. Dane będą analizowane przy użyciu oprogramowania FlowJo w wersji 10.

Zmiana fenotypu i funkcjonalności monocytów:

Próbki krwi na początku badania (przed pierwszą dawką), 28. dnia (4 tygodnie/28 dni po pierwszej dawce i tuż przed drugą dawką), 8 tygodni (lub 4 tygodnie po drugiej dawce), 16 tygodni (lub 12 tygodni po drugiej dawce) , 28 tygodni (lub 24 tygodnie po drugiej dawce), 40 tygodni (lub 36 tygodni po drugiej dawce) i 52 tygodnie (lub 48 tygodni po drugiej dawce) Szczepionka indukuje wzrost produkcji cytokin prozapalnych, co jest zależne od wytrenowanej odporności u wrodzone komórki odpornościowe. Za pomocą analizy cytometrii przepływowej scharakteryzujemy fenotyp i funkcjonalność monocytów przed i po szczepieniu.

Ci, którzy są w pełni uodpornieni i nadal rozwija się kliniczna infekcja Covid 19, zostaną zgrupowani i zbadany zostanie profil immunologiczny.