Безопасность и эффективность нереплицирующейся векторной вакцины ChAdOx1 AZD1222 (COVISHIELD) для профилактики COVID-19 у пациентов с циррозом печени

• Исследуемая популяция: Группа 1: Цирроз печени Группа 2: Контрольная группа (здоровые контроли)
• Дизайн исследования: единый центр, пилотное исследование, адаптивное клиническое испытание
• Период обучения: 1 год. Период зачисления: с марта 2021 г. по август 2021 г.
• Размер выборки с обоснованием:

Исследование проводится как пилотное. В обе группы будут зачислены первые 100 участников. Однако предварительный анализ будет сделан после набора 50 участников в каждую группу. Исследование проводится как адаптивное клиническое испытание.

• Вмешательство:

  2 в/м дозы (0,5 мл) AZD1222 (Covishield) в день 0 и через 6-8 недель после первой дозы (дни 42-56). Этот график будет соблюдаться для первых 100 участников, после чего график вакцинации в соответствии с действующими правительственными протоколами будет соблюдаться как часть адаптивного клинического испытания.

• Мониторинг и оценка:

Уровни IgG в сыворотке SARS CoV2 и титры нейтрализующих антител:

Образцы крови на исходном уровне (до первой дозы), на 28-й день (4 недели/28 дней после первой дозы и непосредственно перед второй дозой), 8 недель (или 4 недели после второй дозы), 16 недель (или 12 недель после второй дозы) , 28 недель (или 24 недели после второй дозы), 40 недель (или 36 недель после второй дозы) и 52 недели (или 48 недель после второй дозы). хемилюминесцентные иммуноанализы (ХЛИА) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA) на автоматизированном приборе VITROS ECi/ECiQ/3600. Результаты будут выражены как реактивные с отношением сыворотка/отсечение ≥ 1 и нереактивные с отношением S/Co < 1.

Все реактивные образцы будут дополнительно обработаны для измерения титра нейтрализующих антител с использованием коммерческого анализа на основе ELISA (sVNT) на нейтрализацию суррогатного вируса (набор для обнаружения нейтрализующих антител GenScript cPass™ SARS-CoV-2) для поиска реакции нейтрализующих антител на шиповидный белок. вируса.

ПЦР в реальном времени на инфекцию SARS CoV-2:

Диагноз инфекции SARSCoV-2 будет подтвержден проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени (ОТ-ПЦР) на комбинированном мазке из носоглотки и полости рта, собранном в вирусной транспортной среде, и обнаружением не менее 2 специфических генов-мишеней SARS. Вирус CoV-2 (гены E и RdRP).

Первичный анализ IFN-γ ELISPOT. Образцы крови на исходном уровне (до первой дозы), на 28-й день (4 недели/28 дней после первой дозы и непосредственно перед второй дозой), 8 недель (или 4 недели после второй дозы), 16 недель (или 12 недель после второй дозы) , 28 недель (или 24 недели после второй дозы), 40 недель (или 36 недель после второй дозы) и 52 недели (или 48 недель после второй дозы). В первую очередь, клеточные ответы будут оцениваться с использованием анализа ex-vivo фермент-связанного иммунного пятна интерферона-γ (ELISpot) для подсчета антиген-специфических Т-клеток. Вкратце, РВМС выделяют из цельной крови центрифугированием в градиенте плотности, немедленно криоконсервируют в 90% фетальной телячьей сыворотке и 10% диметилсульфоксиде и переносят в жидкий азот для хранения.

Анализы IFN-γ ELISPOT будут выполняться с использованием криоконсервированных РВМС. Вкратце, нефракционированные РВМС оттаивают, ресуспендируют в концентрации 1×106 клеток/мл в среде DMEM и высеивают по 100 мкл/лунку (1×105 клеток/лунку) в 96-луночные планшеты с нитроцеллюлозным покрытием ( Millipore Corp, Бедфорд, Массачусетс), предварительно покрытые раствором моноклонального антитела против IFN-γ в PBS (1-D1K, 5 мкг/мл; Mabtech Technologies, Нака, Швеция). Наряду с отрицательным контролем в качестве положительного контроля будут использоваться различные клеточные стимулы (ФМА, фитогемагглютинин 1 мкг/мл и иономицин). Затем планшеты инкубируют при 37°C в течение 40 часов, а затем собирают и считывают в ридере ELISPOT. Вакцино-индуцированный ответ будет определяться как ≥3-кратное увеличение по сравнению с исходным ответом на отдельный эпитопный пептид.

Т-клетки Функциональность:

Образцы крови на исходном уровне (до первой дозы), на 28-й день (4 недели/28 дней после первой дозы и непосредственно перед второй дозой), 8 недель (или 4 недели после второй дозы), 16 недель (или 12 недель после второй дозы) , 28 недель (или 24 недели после второй дозы), 40 недель (или 36 недель после второй дозы) и 52 недели (или 48 недель после второй дозы). моменты времени.

Для исследования функциональности CD4 и CD8 Т-клеток РВМС будут культивировать в 96-луночном планшете в среде RPMI, содержащей 10% FBS, с или без PMA/иономицина (положительный контроль) (PMA 2 нг/мл; иономицин 1 мкг/мл; Merck, Дармштадт, Германия) и 10 мкг/мл LPS (Merck, Дармштадт, Германия) при 37°C, 5% CO2 в течение 6-7 часов. Через 1 час инкубации во все лунки добавляют 1 мкг/мл брефельдина А (BD Pharmingen, США). После инкубации поверхность клеток будет окрашиваться в течение 25–30 минут анти-CD3FITC, анти-CD8BV421 и анти-CD4 PE/цианином 5.5 (Cy5) с последующей 10-минутной пермеабилизацией с помощью 100 мкл пермеабилизирующего раствора (BD Biosciences, США). и будет дважды промыт 500 мкл 1x цитоперм. После промывки клетки окрашивают на предмет внутриклеточной экспрессии IL-2, IFN-γ и IL-17 анти-IL2 APC, анти-IFN-γ PE, анти-IL-17 PE-Cy7 (BD Biosciences and Pharmingen, USA). ) и будет инкубироваться в течение 25-30 минут с последующим промыванием PBS и фиксацией клеток в 0,1% PFA перед получением на проточном цитометре BD Verse. Данные будут проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo версии 10.

Переключение фенотипа и функциональности моноцитов:

Образцы крови на исходном уровне (до первой дозы), на 28-й день (4 недели/28 дней после первой дозы и непосредственно перед второй дозой), 8 недель (или 4 недели после второй дозы), 16 недель (или 12 недель после второй дозы) , 28 недель (или 24 недели после второй дозы), 40 недель (или 36 недель после второй дозы) и 52 недели (или 48 недель после второй дозы) Вакцина вызывает увеличение продукции провоспалительных цитокинов, которая зависит от тренированного иммунитета у клетки врожденного иммунитета. Мы охарактеризуем фенотип и функциональность моноцитов до вакцинации и после вакцинации с помощью проточного цитометрического анализа.

Те, кто полностью иммунизирован и у них все еще развивается клиническая инфекция Covid 19, будут объединены в группы, и будет изучен их иммунологический профиль.