Sicherheit und Wirksamkeit eines nicht-replizierenden ChAdOx1-Vektor-Impfstoffs AZD1222 (COVISHIELD) zur Prävention von COVID-19 bei Patienten mit Leberzirrhose

• Studienpopulation: Gruppe 1: Leberzirrhose Gruppe 2: Kontrollgruppe (gesunde Kontrollgruppe)
• Studiendesign: Ein einzelnes Zentrum, Pilotstudie, adaptive klinische Studie
• Studiendauer: 1 Jahr, Einschreibungszeitraum: März 2021 bis August 2021
• Stichprobenumfang mit Begründung:

Die Studie wird als Pilotstudie durchgeführt. Die ersten 100 Teilnehmer werden in beide Gruppen eingeschrieben. Eine vorläufige Analyse wird jedoch nach Anmeldung von 50 Teilnehmern in jeder Gruppe durchgeführt. Die Studie wird als adaptive klinische Studie durchgeführt.

• Intervention:

  2 IM-Dosen (0,5 ml) von AZD1222 (Covishield) an Tag 0 und nach 6-8 Wochen der ersten Dosis (Tag 42-56 Tage). Dieser Zeitplan wird für die ersten 100 Teilnehmer befolgt, woraufhin der Impfplan gemäß den geltenden Regierungsprotokollen als Teil der adaptiven klinischen Studie befolgt wird.

• Überwachung und Bewertung:

SARS-CoV2-Serum-IgG-Spiegel und neutralisierende Antikörpertiter:

Die Blutproben zu Studienbeginn (vor der ersten Dosis), Tag 28 (4 Wochen/28 Tage nach der ersten Dosis und unmittelbar vor der zweiten Dosis), 8 Wochen (oder 4 Wochen nach der zweiten Dosis), 16 Wochen (oder 12 Wochen nach der zweiten Dosis) , 28 Wochen (oder 24 Wochen nach der zweiten Dosis), 40 Wochen (oder 36 Wochen nach der zweiten Dosis) und 52 Wochen (oder 48 Wochen nach der zweiten Dosis) Nach der Impfung wird auf im Handel erhältliches Anti-SARS-CoV-2-IgG untersucht Chemilumineszenz-Immunoassays (CLIA) SARS-CoV-2 IgG (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA) auf dem automatisierten Instrument VITROS ECi/ECiQ/3600. Die Ergebnisse werden als reaktiv mit einem Serum/Cut-off-Verhältnis ≥ 1 und als nicht reaktiv mit einem S/Co-Verhältnis von < 1 ausgedrückt.

Alle reaktiven Proben werden weiterverarbeitet, um den neutralisierenden Antikörpertiter unter Verwendung eines Surrogat-Virus-Neutralisierungstest-ELISA-basierten kommerziellen Assays (sVNT) (GenScript cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit) zu messen, um nach einer neutralisierenden Antikörperantwort auf das Spike-Protein zu suchen vom Virus.

Real Time PCR für SARS-CoV-2-Infektion:

Eine Diagnose einer SARSCoV-2-Infektion wird durch die Durchführung einer Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) an dem kombinierten Nasen-Rachen- und Mundabstrich, der in einem viralen Transportmedium gesammelt wurde, und durch den Nachweis von mindestens 2 spezifischen Genzielen des SARS bestätigt CoV-2-Virus (E- und RdRP-Gene).

Primärer IFN-γ-ELISPOT-Assay. Die Blutproben zu Studienbeginn (vor der ersten Dosis), Tag 28 (4 Wochen/28 Tage nach der ersten Dosis und unmittelbar vor der zweiten Dosis), 8 Wochen (oder 4 Wochen nach der zweiten Dosis), 16 Wochen (oder 12 Wochen nach der zweiten Dosis) , 28 Wochen (oder 24 Wochen nach der zweiten Dosis), 40 Wochen (oder 36 Wochen nach der zweiten Dosis) und 52 Wochen (oder 48 Wochen nach der zweiten Dosis) werden gesammelt. In erster Linie werden die zellulären Reaktionen mit einem Ex-vivo-Interferon-γ-Enzyme-Linked-Immunospot (ELISpot)-Assay bewertet, um Antigen-spezifische T-Zellen zu zählen. Kurz gesagt, PBMCs werden durch Dichtegradientenzentrifugation aus Vollblut isoliert, sofort in 90 % fötalem Rinderserum und 10 % Dimethylsulfoxid kryokonserviert und zur Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt.

IFN-γ ELISPOT-Assays werden mit kryokonservierten PBMC durchgeführt. Kurz gesagt, unfraktionierte PBMC werden aufgetaut, in einer Konzentration von 1 × 10 6 Zellen/ml in DMEM-Medium resuspendiert und mit 100 &mgr;l/Vertiefung (1 × 10 5 Zellen/Vertiefung) in 96-Well-Platten mit Nitrocellulose-Rückseite ausplattiert ( Millipore Corp, Bedford, MA), die zuvor mit einer PBS-Lösung von monoklonalem Anti-IFN-γ-Antikörper (1-D1K, 5 &mgr;g/ml; Mabtech Technologies, Nacka, Schweden) beschichtet wurden. Neben der Negativkontrolle werden verschiedene Zellstimuli (PMA; Phytohämagglutinin 1 μg/ml und Ionomycin ) als Positivkontrollen verwendet., Die Platten werden dann 40 h lang bei 37 °C inkubiert und dann geerntet und im ELISPOT-Lesegerät gelesen. Eine impfstoffinduzierte Reaktion wird als eine ≥ 3-fache Steigerung gegenüber der Ausgangsreaktion auf das einzelne Epitop-Peptid definiert.

T-Zellen Funktionalität:

Die Blutproben zu Studienbeginn (vor der ersten Dosis), Tag 28 (4 Wochen/28 Tage nach der ersten Dosis und unmittelbar vor der zweiten Dosis), 8 Wochen (oder 4 Wochen nach der zweiten Dosis), 16 Wochen (oder 12 Wochen nach der zweiten Dosis) , 28 Wochen (oder 24 Wochen nach der zweiten Dosis), 40 Wochen (oder 36 Wochen nach der zweiten Dosis) und 52 Wochen (oder 48 Wochen nach der zweiten Dosis). Zeitpunkte.

Um die Funktionalität von CD4- und CD8-T-Zellen zu untersuchen, werden PBMCs in 96-Well-Platten in RPMI-Medium mit 10 % FBS kultiviert, mit oder ohne PMA/Ionomycin (Positivkontrolle) (PMA 2 ng/ml; Ionomycin 1 μg/ml; Merck, Darmstadt, Deutschland) und 10 ug/ml LPS (Merck, Darmstadt, Deutschland) bei 37°C, 5% CO2 für 6–7 Stunden. Nach 1-stündiger Inkubation werden 1 μg/ml Brefeldin A (BD Pharmingen, USA) in alle Vertiefungen gegeben. Nach der Inkubation werden die Zellen für 25-30 Minuten mit Anti-CD3FITC, Anti-CD8BV421 und Anti-CD4 PE/Cyanin5.5 (Cy5) oberflächengefärbt, gefolgt von einer 10-minütigen Permeabilisierung mit 100 µl Permeabilisierungslösung (BD Biosciences, USA). und wird zweimal mit 500 µL 1x Cytoperm gewaschen. Nach dem Waschen werden die Zellen für die intrazelluläre Expression von IL-2, IFN-γ und IL-17 mit Anti-IL2-APC, Anti-IFN-γ-PE, Anti-IL-17-PE-Cy7 (BD Biosciences und Pharmingen, USA) gefärbt ) und werden 25–30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von Waschen mit PBS und Fixieren der Zellen in 0,1 % PFA, bevor sie auf einem BD Verse-Durchflusszytometer erfasst werden. Die Daten werden mit der FlowJo-Softwareversion 10 analysiert.

Wechsel des Monozyten-Phänotyps und -Funktionalität:

Die Blutproben zu Studienbeginn (vor der ersten Dosis), Tag 28 (4 Wochen/28 Tage nach der ersten Dosis und unmittelbar vor der zweiten Dosis), 8 Wochen (oder 4 Wochen nach der zweiten Dosis), 16 Wochen (oder 12 Wochen nach der zweiten Dosis) , 28 Wochen (oder 24 Wochen nach der zweiten Dosis), 40 Wochen (oder 36 Wochen nach der zweiten Dosis) und 52 Wochen (oder 48 Wochen nach der zweiten Dosis) Der Impfstoff induziert eine Erhöhung der proinflammatorischen Zytokinproduktion, die von der trainierten Immunität abhängt angeborene Immunzellen. Wir werden den Phänotyp und die Funktionalität von Monozyten vor der Impfung und nach der Impfung mittels durchflusszytometrischer Analyse charakterisieren.

Diejenigen, die vollständig immunisiert sind und noch eine klinische Covid-19-Infektion entwickeln, werden in Gruppen zusammengefasst und das immunologische Profil wird untersucht.