再発寛解型多発性硬化症患者における制御性T細胞（Treg）機能の欠損

この研究には、40 人の RRMS 患者 (18 ～ 55 歳、拡張障害状態尺度 (EDSS) 0 ～ 6) と、年齢、性別、および人種が一致する 40 人の健康な対照 (HC) が登録されます。 研究対象は、三次紹介センターとして機能するトーマス・ジェファーソン大学MSクリニックに登録されます。

選択基準は、マクドナルドの診断基準に従って RRMS の診断が確認されていること、18 歳から 55 歳までの年齢、拡張障害ステータス スコア (EDSS) 1.5 から 5.5、および研究時に免疫調節療法を受けていないことです。 IVメチルプレドニゾロン、インターフェロンベータ、グラチラマーアセテート、フィンゴリモド、テクフィデラ、ナタリズマブの場合、治療のない期間は少なくとも4週間です。 以前にアザチオプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、シクロホスファミドなどの免疫抑制療法で治療された患者は、研究に登録されません。 除外基準には、付随する感染症、主治医の裁量による重大な医学的および精神医学的状態が含まれます。 妊娠中の女性、および他の研究試験に参加している患者は、この研究に登録されません。 RR MS患者のグループと年齢、性別、および人種が一致する40人の健康なコントロールが、コントロールグループとして研究に登録されます。

目的 1. A. RRMS 患者における CD4+CD25+CD127-nTreg の表現型の変化を特定します。

ソートされた CD4+CD25+CD127-Treg の転写プロファイリングは、10 人の HC と 10 人の RRMS 患者の最初のコホートで RNAseq を使用して実行されます。 CD4+CD25+CD127- Treg 細胞は、磁気ビーズで分離された CD4+ 細胞から選別されます。 cDNA は、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing を使用して生成されます。 RRMS 患者と HC 由来の Treg 細胞の間で差次的に発現する遺伝子を検出することで、RRMS における Treg 細胞の機能的特徴付けが可能になります。 RNA シーケンス実験とデータ解析は、TJU シドニー キンメルがんセンターの Paolo Fortina 博士と Adam Ertel 博士によって行われます。 RNAseq によって識別された RRMS Tregs の異なる遺伝子発現は、RT-PCR およびウェスタンブロッティングによって確認されます。

HCおよびRRMS患者（各グループに10人のドナー）の第2コホートからの末梢血単核細胞（PBMC）サンプルを使用したフローサイトメトリー研究は、RRMS患者のTregタンパク質マーカーの発現の変化を決定するために使用されます。 個々の Treg マーカーは、特定の抑制メカニズムを付与します。 包括的な Treg 表現型プロファイリングのために、研究者は、CTLA-4、CD39、GZB、パーフォリン、GITR、OX40、HLADR、TNFR2、Tim-3、プログラム死受容体 (PD-1)、および LAG3 陽性細胞の割合を決定します。 CD4+CD25+CD127--ゲートされたTreg。 FOXP3、GZB、およびパーフォリンの発現は、細胞内染色、ならびにそれらの抑制機能に寄与する可能性のある Treg の TGF-B、IL-10、および IL-35 サイトカイン分泌を使用して決定されます (14 色染色あたり 2x106 PBMC)。

目的 1.B. RRMS における nTreg の機能的欠損を特徴付けます。 機能抑制アッセイは、10 人の HC 患者と 10 人の RRMS 患者の第 3 コホートにおける Treg 抑制機能を比較します。

仮説は、HC からの Teff 細胞との Treg 共培養は、TGF-B、IL-10、および IL-35 の濃度を増加させ、培養上清 (SN) 中の IFN-γ および IL-17A の濃度を減少させるというものです。 RRMS患者のTregおよびTeff細胞を使用した抑制アッセイ。 HCと比較してRRMS患者のTeff細胞の感受性を調べるために、クロスオーバーデザイン実験で抑制アッセイを行います。

1. RMS Treg+RRMS Teff 細胞
2. HC Treg+HC Teff 細胞
3. RRMS Treg+HC Teff 細胞
4. HC Treg+RRMS Teff 細胞

条件ごとに選別された 2x104 個の CD4+CD25+CD127- Treg を、aCD3 (0.5 ug/ml) および aCD28 (1 ug/ml) mAb および 105照射された抗原提示細胞 (PBMC - CD4+ 細胞) を 1:1 および 1:10 の比率で。 研究者は、Teff 細胞の CFSE 希釈と細胞培養の SN でのサイトカイン分泌を介して増殖を測定し、RRMS 患者の Treg 細胞が HC と比較して抑制の低下をどの程度示すかを判断します。 IFN-γ、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-10、TGF-B、およびIL-4サイトカインの測定は、ELISAを使用して実行されます。

目的 1.C. RRMS における nTregs の抑制機能に対する IL-7 の効果を決定します。

私たちの予備データは、IL-7 誘導 STAT5 リン酸化および FOXP3 発現、ならびに IL-7 インビトロ誘導 Treg 増殖を特定したので、研究者は血清 IL-7 レベルを Treg 数と相関させます (CD4+ 細胞の % x細胞の総数）とそれらの抑制機能、およびこのサイトカインとのTregのプレインキュベーションの抑制機能への影響を調べます。

目的 2.A. RRMS 患者の iTreg 細胞の表現型を決定します。 RRMS 患者および HC に由来する IL-10+CD4+ および TGF-B+CD4+ 細胞のフローサイトメトリー研究により、iTreg の疾患特異的表現型が特定されます。これは、RRMS における iTreg の機能変化を反映している可能性があります。 治験責任医師は、特定の目的 1.A に登録されている RRMS 患者と HC のコホートからの同じサンプルを調べます。ゲートされた CD4+IL-10+ および CD4+TGF-B+ 細胞のフローサイトメトリー研究は、CD39、CTLA-4、PD-1、ICOS、CD46、CD49b、および LAG-3 の表面マーカー染色と、 FOXP3、IL-35、GZMB、pSTAT3、GATA-3 (ROG) のリプレッサー、アリール炭化水素受容体 (AhR)、および c-Maf 転写因子。

目的 2.B. RRMS における iTreg の不完全な nTreg 誘導のメカニズムを特定します。

１０人のＨＣおよび１０人のＲＲＭＳ患者の第４コホート由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋Ｔｅｆｆ細胞を使用して、目的１．Ｂに記載されるように抑制アッセイを実施する。 4日間の共培養後、磁気ビーズを使用してCD25+ Treg細胞を除去し、残りのCD4+CD25-細胞を照射し、自家CD4+CD25- T細胞と1:10の比率で再播種し、プレートで刺激しますiTregs の抑制効果を実証するために、さらに 5 日間 aCD3 および aCD28 mAb を固定化しました。 エフェクター CD4+ 細胞で CD4+CD25+CD127-Treg によって誘導される iTreg 抑制機能を決定するために、SN での細胞増殖 (3[H] 取り込みによって測定) および TGF-β と IL-10 の分泌を測定します。 2 回目の共培養では、研究者は、iTreg 誘導が細胞間接触 (透過膜によってブロックされる) または可溶性サイトカイン (aIL-10、aTGF-B、または aIL によってブロックされる) を介してどの程度媒介されるかについても調べます。 -4 mAb)。

目的 2.C. 免疫寛容の再構築に対する iTreg 産生免疫調節性サイトカインの効果を特徴付けます。

治験責任医師は、上記の共培養の SN における IFN-γ、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-9、および IL-10、TGF-B、および IL-35 レベルを測定します。 48時間でのRRMS患者およびHCに由来するiTregおよびCD4 +細胞の。 調査員は、CD19+ ゲート B 細胞、CD14+ ゲート単球、私たちの以前の研究で報告されているように、フローサイトメトリーを使用したCD1cゲートDCおよびCD1cゲートDC。 研究者らは、iTreg 数と iTreg の IL-10 および TGF-B 産生、ならびに IL-10 および TGF-B 血清レベルが、B 細胞、単球および単球における MHC および共刺激分子の発現の阻害とどの程度相関しているかを調べますHCおよびRRMS患者のDC。