Função deficiente das células reguladoras T (Treg) em pacientes com esclerose múltipla recorrente remitente

O estudo incluirá 40 pacientes com EMRR (idade 18-55, escala expandida de status de incapacidade (EDSS) 0-6) e 40 controles saudáveis ​​(HCs) pareados por idade, sexo e raça. Os sujeitos do estudo serão matriculados na clínica de MS da Thomas Jefferson University, que serve como um centro de referência terciário.

Os critérios de inclusão são diagnóstico confirmado de EMRR de acordo com os critérios diagnósticos de McDonald's12, idade de 18 a 55 anos, pontuação estendida do estado de incapacidade (EDSS) 1,5-5,5 e nenhuma terapia imunomoduladora no momento do estudo. O período sem tratamento será de pelo menos 4 semanas para Metilprednisolona IV, Interferon-beta, Acetato de Glatiramer, Fingolimod, Tecfidera e Natalizumab. Pacientes previamente tratados com terapias imunossupressoras, incluindo Azatioprina, Metotrexato, Mitoxantrona e Ciclofosfamida não serão incluídos no estudo. Os critérios de exclusão incluirão infecção concomitante, condição médica e psiquiátrica significativa, a critério do investigador principal. Mulheres grávidas e pacientes que participam de outros ensaios de pesquisa não serão incluídos neste estudo. 40 controles saudáveis ​​pareados por idade, sexo e raça com o grupo de pacientes com EM RR serão incluídos no estudo como um grupo de controle.

Objetivo 1. A. Identificar as alterações fenotípicas em CD4+CD25+CD127-nTregs em pacientes com EMRR.

O perfil de transcrição de Tregs CD4+CD25+CD127- classificados será realizado usando RNAseq na primeira coorte de 10 HCs e 10 pacientes com EMRR. As células Treg CD4+CD25+CD127- serão separadas das células CD4+ separadas por grânulos magnéticos. O cDNA será gerado usando o kit de RNA de entrada ultrabaixa SMART-Seq v4 para sequenciamento. A detecção de genes diferencialmente expressos entre pacientes com EMRR e células Treg derivadas de HC permitirá a caracterização funcional de células Treg em EMRR. Os experimentos de seq de RNA e análise de dados serão realizados pelo Dr. Paolo Fortina e Dr. Adam Ertel no TJU Sidney Kimmel Cancer Center. A expressão gênica diferencial em Tregs RRMS identificada por RNAseq será confirmada via RT-PCR e western blotting.

Estudos de citometria de fluxo usando as amostras de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) da segunda coorte de pacientes com HCs e EMRR (10 doadores em cada grupo) serão usados ​​para determinar alterações na expressão dos marcadores de proteínas Treg em pacientes com EMRR. Marcadores Treg individuais conferem mecanismos específicos de supressão. Para o perfil fenotípico abrangente de Treg, os investigadores determinarão a porcentagem de células CTLA-4, CD39, GZB, perforina, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, receptor de morte programada (PD-1) e LAG3-positivo dentro as Tregs controladas por CD4+CD25+CD127. A expressão de FOXP3, GZB e perforina será determinada por meio de coloração intracelular, bem como a secreção de citocinas TGF-B, IL-10 e IL-35 de Tregs, que podem contribuir para sua função supressora (2x106 PBMCs por coloração de 14 cores).

Objetivo 1.B. Caracterizar o déficit funcional de nTregs na EMRR. Ensaios de supressão funcional irão comparar a função supressiva de Treg em uma terceira coorte de 10 HC e 10 pacientes com EMRR.

A hipótese é que co-culturas de Treg com células Teff de HCs irão aumentar a concentração de TGF-B, IL-10 e IL-35 e diminuir as concentrações de IFN-y e IL-17A em sobrenadantes de cultura (SNs) em comparação com os ensaios de supressão usando células Treg e Teff de pacientes com EMRR. A fim de examinar a suscetibilidade das células Teff em pacientes com EMRR em comparação com HCs, os ensaios de supressão serão realizados em experimentos de design cruzado:

1. Células RMS Tregs+RRMS Teff
2. Células HC Tregs+HC Teff
3. Células Tregs RRMS+HC Teff
4. Células HC Tregs+RRMS Teff

2x104 células CD4+CD25+CD127- Tregs selecionadas por condição serão co-cultivadas com células CD4+CD25-CD127+ coradas com Teff CFSE autólogas na presença de aCD3 (0,5 ug/ml) e aCD28 (1 ug/ml) mAb e 105 células apresentadoras de antígenos irradiadas (PBMCs - células CD4+) em proporções de 1:1 e 1:10. Os investigadores medirão a proliferação por meio da diluição de CFSE nas células Teff e secreção de citocinas nos SNs de culturas de células para determinar até que ponto as células Treg de pacientes com EMRR exibem diminuição da supressão em comparação com HCs. As dosagens das citocinas IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B e IL-4 serão realizadas por ELISA.

Objetivo 1.C. Determine os efeitos da IL-7 na função supressiva dos nTregs em RRMS.

Uma vez que nossos dados preliminares identificaram a fosforilação de STAT5 induzida por IL-7 e a expressão de FOXP3, bem como a proliferação de Treg induzida por IL-7 in vitro, os investigadores irão correlacionar os níveis séricos de IL-7 com os números de Treg (% de células CD4+ x número total de células) e sua função supressora, e examinar o efeito da pré-incubação de Tregs com esta citocina para sua função supressora.

Objetivo 2.A. Determine o fenótipo das células iTreg em pacientes com EMRR. Estudos de citometria de fluxo das células IL-10+CD4+ e TGF-B+CD4+ derivadas de pacientes com EMRR e HCs identificarão o fenótipo específico da doença de iTregs, que pode refletir alterações funcionais de iTregs em EMRR. Os investigadores examinarão as mesmas amostras da coorte de pacientes com EMRR e HCs inscritos no Objetivo Específico 1.A. Estudos de citometria de fluxo das células CD4+IL-10+ e CD4+TGF-B+ bloqueadas serão realizados usando coloração de marcador de superfície para CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b e LAG-3 e coloração intracelular para FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, o repressor de GATA-3 (ROG), o receptor de hidrocarboneto arílico (AhR) e fatores de transcrição c-Maf.

Objetivo 2.B. Identificar os mecanismos de indução deficiente de nTregs de iTregs em EMRR.

O ensaio supressivo será realizado conforme descrito no Objetivo 1.B usando células CD4+CD25+CD127-Treg e CD4+CD25-CD127+ Teff derivadas da quarta coorte de 10 HCs e 10 pacientes com EMRR. Após 4 dias de co-cultura, as células Treg CD25+ serão removidas com esferas magnéticas, e as células CD4+CD25- restantes serão irradiadas e replaqueadas na proporção de 1:10 com células T CD4+CD25- autólogas, e estimuladas por placa -immobilizou aCD3 e aCD28 mAb por mais 5 dias para demonstrar o efeito supressor de iTregs. A proliferação celular (medida pela incorporação de 3[H]) e a secreção de TGF-β e IL-10 nos SNs serão medidas para determinar a função supressora de iTreg induzida por CD4+CD25+CD127-Tregs nas células efetoras CD4+. Na segunda cocultura, os pesquisadores também examinarão até que ponto a indução de iTreg é mediada por contato célula a célula (bloqueada por uma membrana permeável) ou por citocinas solúveis (bloqueadas por aIL-10, aTGF-B ou aIL -4mAb).

Objetivo 2.C. Caracterizar o efeito das citocinas imunorreguladoras produzidas pelo iTreg na reconstituição da tolerância imunológica.

Os investigadores medirão os níveis de IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 e IL-10, TGF-B e IL-35 nos SNs das coculturas acima de iTregs e células CD4+ derivadas de pacientes com EMRR e CHs em 48 h. Os investigadores medirão a expressão do MHC classe I e II, CD80, CD86, CD40 e CD58 nas demais amostras de PBMC obtidas no Objetivo Específico 2B em 10 HCs e 10 pacientes com EMRR em células B controladas por CD19+, monócitos controlados por CD14+, e DCs controladas por CD1c usando citometria de fluxo, conforme relatado em nosso estudo anterior 43. Os pesquisadores examinarão até que ponto os números de iTreg e a produção de IL-10 e TGF-B de iTregs, bem como os níveis séricos de IL-10 e TGF-B se correlacionam com a inibição da expressão de MHC e moléculas co-estimuladoras em células B, monócitos e CDs em pacientes com HCs e EMRR.