Fonction déficiente des cellules T régulatrices (Treg) chez les patients atteints de sclérose en plaques récurrente-rémittente

L'étude recrutera 40 patients atteints de SEP-RR (âgés de 18 à 55 ans, échelle d'état d'invalidité étendue (EDSS) de 0 à 6) et 40 contrôles sains (HC) appariés selon l'âge, le sexe et la race. Les sujets de l'étude seront inscrits à la clinique de SEP de l'Université Thomas Jefferson, qui sert de centre de référence tertiaire.

Les critères d'inclusion sont un diagnostic confirmé de SEP-RR selon les critères de diagnostic de McDonald's12, âge 18-55 inclus, score d'état d'invalidité étendu (EDSS) 1,5-5,5 et absence de traitement immunomodulateur au moment de l'étude. La période sans traitement sera d'au moins 4 semaines pour la méthylprednisolone IV, l'interféron-bêta, l'acétate de glatiramère, le fingolimod, le Tecfidera et le natalizumab. Les patients précédemment traités avec des thérapies immunosuppressives, y compris l'azathioprine, le méthotrexate, la mitoxantrone et le cyclophosphamide ne seront pas inclus dans l'étude. Les critères d'exclusion comprendront une infection concomitante, une condition médicale et psychiatrique importante à la discrétion du chercheur principal. Les femmes enceintes et les patients participant à d'autres essais de recherche ne seront pas inscrits à cette étude. 40 témoins sains appariés pour l'âge, le sexe et la race avec le groupe de patients atteints de SEP RR seront inscrits à l'étude en tant que groupe témoin.

Objectif 1. A. Identifier les modifications phénotypiques des CD4+CD25+CD127-nTregs chez les patients atteints de SEP-RR.

Le profilage transcriptionnel de CD4+CD25+CD127-Tregs triés sera réalisé à l'aide de RNAseq dans la première cohorte de 10 patients HC et 10 patients SEP-RR. Les cellules CD4 + CD25 + CD127- Treg seront triées à partir de cellules CD4 + séparées par des billes magnétiques. L'ADNc sera généré à l'aide du kit d'ARN à entrée ultra faible SMART-Seq v4 pour le séquençage. La détection de gènes différentiellement exprimés entre les patients RRMS et les cellules Treg dérivées de HC permettra la caractérisation fonctionnelle des cellules Treg dans la RRMS. Les expériences de séquençage d'ARN et l'analyse des données seront effectuées par le Dr Paolo Fortina et le Dr Adam Ertel au TJU Sidney Kimmel Cancer Center. L'expression différentielle des gènes dans les RRMS Tregs identifiés par RNAseq sera confirmée par RT-PCR et western blot.

Des études de cytométrie en flux utilisant les échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) de la deuxième cohorte de patients HC et RRMS (10 donneurs dans chaque groupe) seront utilisées pour déterminer les changements dans l'expression des marqueurs protéiques Treg chez les patients RRMS. Les marqueurs Treg individuels confèrent des mécanismes spécifiques de suppression. Pour le profilage phénotypique complet des Treg, les chercheurs détermineront le pourcentage de CTLA-4, CD39, GZB, perforine, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, récepteur de mort programmée (PD-1) et cellules LAG3-positives dans les Tregs contrôlés CD4+CD25+CD127. L'expression de FOXP3, GZB et de la perforine sera déterminée à l'aide d'une coloration intracellulaire, ainsi que de la sécrétion de cytokines TGF-B, IL-10 et IL-35 des Tregs, qui peuvent contribuer à leur fonction suppressive (2x106 PBMC par coloration de 14 couleurs).

Objectif 1.B. Caractériser le déficit fonctionnel des nTregs dans la RRMS. Les essais de suppression fonctionnelle compareront la fonction suppressive des Treg dans une troisième cohorte de 10 patients HC et 10 patients RRMS.

L'hypothèse est que les co-cultures de Treg avec des cellules Teff de HC augmenteront la concentration de TGF-B, IL-10 et IL-35 et diminueront les concentrations d'IFN-y et IL-17A dans les surnageants de culture (SN) par rapport à les tests de suppression utilisant des cellules Treg et Teff de patients atteints de SEP-RR. Afin d'examiner la sensibilité des cellules Teff chez les patients atteints de SEP-RR par rapport aux HC, les tests de suppression seront effectués dans le cadre d'expériences de conception croisée :

1. Cellules RMS Tregs + RRMS Teff
2. Cellules HC Tregs+HC Teff
3. Cellules RRMS Tregs + HC Teff
4. Cellules HC Tregs + RRMS Teff

2x104 CD4+CD25+CD127- Tregs triés par condition seront co-cultivés avec des cellules autologues Teff CFSE colorées CD4+CD25-CD127+ en présence d'aCD3 (0,5 ug/ml) et d'aCD28 (1 ug/ml) mAb et 105 cellules présentatrices d'antigène irradiées (PBMC - cellules CD4+) à des rapports de 1:1 et 1:10. Les chercheurs mesureront la prolifération via la dilution CFSE dans les cellules Teff et la sécrétion de cytokines dans les SN des cultures cellulaires afin de déterminer dans quelle mesure les cellules Treg des patients atteints de SEP-RR présentent une diminution de la suppression par rapport aux HC. Les mesures des cytokines IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B et IL-4 seront effectuées par ELISA.

Objectif 1.C. Déterminer les effets de l'IL-7 sur la fonction suppressive des nTregs dans RRMS.

Étant donné que nos données préliminaires ont identifié la phosphorylation de STAT5 induite par l'IL-7 et l'expression de FOXP3, ainsi que la prolifération de Treg induite par l'IL-7 in vitro, les chercheurs établiront une corrélation entre les taux sériques d'IL-7 et les nombres de Treg (% de cellules CD4+ x nombre total de cellules) et leur fonction suppressive, et examiner l'effet de la pré-incubation des Treg avec cette cytokine sur leur fonction suppressive.

Objectif 2.A. Déterminer le phénotype des cellules iTreg chez les patients SEP-RR. Les études de cytométrie en flux des cellules IL-10 + CD4 + et TGF-B + CD4 + dérivées de patients atteints de SEP-RR et de HC identifieront le phénotype spécifique à la maladie des iTregs, qui peut refléter des changements fonctionnels des iTregs dans la SEP-RR. Les enquêteurs examineront les mêmes échantillons de la cohorte de patients atteints de SEP-RR et de HC inscrits à l'objectif spécifique 1.A. Des études de cytométrie en flux des cellules fermées CD4 + IL-10 + et CD4 + TGF-B + seront réalisées à l'aide d'une coloration par marqueur de surface pour CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b et LAG-3 et d'une coloration intracellulaire pour FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, le répresseur de GATA-3 (ROG), le récepteur d'aryl-hydrocarbure (AhR) et les facteurs de transcription c-Maf.

Objectif 2.B. Identifier les mécanismes d'induction nTreg déficiente d'iTregs dans RRMS.

Les tests de suppression seront effectués comme décrit dans l'objectif 1.B en utilisant des cellules CD4 + CD25 + CD127-Treg et CD4 + CD25-CD127 + Teff dérivées de la quatrième cohorte de 10 HC et 10 patients atteints de SEP-RR. Après 4 jours de co-culture, les cellules CD25+ Treg seront éliminées à l'aide de billes magnétiques, et les cellules CD4+CD25- restantes seront irradiées et replaquées à un ratio de 1:10 avec des cellules CD4+CD25-T autologues, et stimulées par plaque - mAb aCD3 et aCD28 immobilisés pendant 5 jours supplémentaires afin de démontrer l'effet suppresseur des iTregs. La prolifération cellulaire (mesurée par l'incorporation de 3[H]) et la sécrétion de TGF-β et d'IL-10 dans les SN seront mesurées pour déterminer la fonction suppressive de l'iTreg induite par les CD4+CD25+CD127-Tregs dans les cellules effectrices CD4+. Dans la deuxième co-culture, les chercheurs examineront également dans quelle mesure l'induction d'iTreg est médiée par le contact de cellule à cellule (bloquée par une membrane perméable) ou par des cytokines solubles (bloquées par aIL-10, aTGF-B ou aIL -4 mAb).

Objectif 2.C. Caractériser l'effet des cytokines immunorégulatrices produites par iTreg sur la reconstitution de la tolérance immunitaire.

Les chercheurs mesureront les niveaux d'IFN-y, d'IL-17A, d'IL-17F, d'IL-21, d'IL-22, d'IL-9 et d'IL-10, de TGF-B et d'IL-35 dans les SN des co-cultures ci-dessus d'iTregs et de cellules CD4+ dérivées de patients atteints de SEP-RR et de CH à 48 h. Les chercheurs mesureront l'expression des CMH de classe I et II, CD80, CD86, CD40 et CD58 dans les échantillons de PBMC restants obtenus dans l'objectif spécifique 2B chez 10 HC et 10 patients atteints de SEP-RR dans les cellules B dépendantes de CD19+, les monocytes dépendants de CD14+, et CD1c-dépendantes utilisant la cytométrie en flux, comme indiqué dans notre étude précédente 43. Les chercheurs examineront dans quelle mesure les nombres d'iTreg et la production d'IL-10 et de TGF-B des iTreg, ainsi que les taux sériques d'IL-10 et de TGF-B sont corrélés à l'inhibition de l'expression du CMH et des molécules costimulatrices dans les cellules B, les monocytes et DC chez les patients HC et RRMS.