Дефицит функции Т-регуляторных клеток (Treg) у пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом

В исследовании примут участие 40 пациентов с РРРС (возраст 18–55 лет, расширенная шкала статуса инвалидности (EDSS) 0–6) и 40 здоровых людей из контрольной группы (HCs) того же возраста, пола и расы. Субъекты исследования будут зачислены в клинику MS Университета Томаса Джефферсона, которая служит высшим справочным центром.

Критерии включения: подтвержденный диагноз РРРС в соответствии с диагностическими критериями McDonald's12, возраст от 18 до 55 лет включительно, расширенная шкала статуса инвалидности (EDSS) 1,5–5,5 и отсутствие иммуномодулирующей терапии на момент исследования. Период без лечения будет составлять не менее 4 недель для внутривенного введения метилпреднизолона, интерферона-бета, глатирамера ацетата, финголимода, текфидера и натализумаба. Пациенты, ранее получавшие иммуносупрессивную терапию, включая азатиоприн, метотрексат, митоксантрон и циклофосфамид, не будут включены в исследование. Критерии исключения будут включать сопутствующую инфекцию, серьезное медицинское и психическое состояние по усмотрению главного исследователя. Беременные женщины и пациенты, участвующие в других исследованиях, не будут участвовать в этом исследовании. 40 здоровых контролей, соответствующих по возрасту, полу и расе группе пациентов с РР-РС, будут включены в исследование в качестве контрольной группы.

Цель 1. А. Выявить изменения фенотипа в CD4+CD25+CD127-nTregs у пациентов с РРС.

Профилирование транскрипции отсортированных CD4+CD25+CD127-Treg будет проводиться с использованием RNAseq в первой когорте из 10 пациентов с HCs и 10 пациентов с RRMS. Клетки CD4+CD25+CD127-Treg будут отсортированы из магнитных шариков, разделенных клетками CD4+. кДНК будет создана с использованием набора РНК SMART-Seq v4 Ultra Low Input для секвенирования. Обнаружение дифференциально экспрессируемых генов между пациентами с RRMS и клетками Treg, происходящими из HC, позволит получить функциональную характеристику клеток Treg при RRMS. Эксперименты с секвенированием РНК и анализ данных будут выполнять доктор Паоло Фортина и доктор Адам Эртель в Онкологическом центре TJU Sidney Kimmel Cancer Center. Дифференциальная экспрессия генов в RRMS Tregs, идентифицированная с помощью RNAseq, будет подтверждена с помощью RT-PCR и вестерн-блоттинга.

Исследования проточной цитометрии с использованием образцов мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) из второй когорты пациентов с HCs и RRMS (по 10 доноров в каждой группе) будут использоваться для определения изменений экспрессии маркеров белка Treg у пациентов с RRMS. Отдельные маркеры Treg обеспечивают специфические механизмы подавления. Для всестороннего фенотипического профилирования Treg исследователи определят процент CTLA-4, CD39, GZB, перфорина, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, рецептора запрограммированной смерти (PD-1) и LAG3-позитивных клеток в организме. CD4+CD25+CD127-закрытые Treg. Экспрессия FOXP3, GZB и перфорина будет определяться с помощью внутриклеточного окрашивания, а также секреции цитокинов TGF-B, IL-10 и IL-35 Treg, что может способствовать их супрессивной функции (2x106 РВМС на 14 окрашиваний).

Цель 1.Б. Охарактеризуйте функциональный дефицит nTreg при RRMS. Анализы функциональной супрессии будут сравнивать супрессивную функцию Treg в третьей когорте из 10 пациентов с HC и 10 RRMS.

Гипотеза состоит в том, что совместное культивирование Treg с клетками Teff из HC повысит концентрацию TGF-B, IL-10 и IL-35 и снизит концентрацию IFN-γ и IL-17A в культуральных супернатантах (SN) по сравнению с анализы подавления с использованием клеток Treg и Teff от пациентов с RRMS. Чтобы изучить восприимчивость клеток Teff у пациентов с RRMS по сравнению с HC, анализы подавления будут выполняться в экспериментах с перекрестным дизайном:

1. Клетки RMS Tregs + RRMS Teff
2. Клетки HC Tregs + HC Teff
3. Клетки RRMS Tregs + HC Teff
4. Клетки HC Tregs + RRMS Teff

Отсортированные 2x104 CD4+CD25+CD127-Treg в каждом условии будут совместно культивироваться с аутологичными клетками CD4+CD25-CD127+, окрашенными Teff CFSE, в присутствии mAb aCD3 (0,5 мкг/мл) и aCD28 (1 мкг/мл) и 105 облученные антигенпрезентирующие клетки (РВМС - клетки CD4+) в соотношениях 1:1 и 1:10. Исследователи будут измерять пролиферацию с помощью разбавления CFSE в клетках Teff и секрецию цитокинов в SNs клеточных культур, чтобы определить, в какой степени Treg-клетки от пациентов с RRMS демонстрируют пониженную супрессию по сравнению с HCs. Измерения цитокинов IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B и IL-4 будут выполняться с использованием ELISA.

Цель 1.С. Определите влияние IL-7 на супрессивную функцию nTregs при RRMS.

Поскольку наши предварительные данные идентифицировали индуцированное ИЛ-7 фосфорилирование STAT5 и экспрессию FOXP3, а также индуцированную ИЛ-7 пролиферацию Treg in vitro, исследователи будут коррелировать уровни ИЛ-7 в сыворотке с количеством Treg (% клеток CD4+ x общее количество клеток) и их супрессорную функцию, а также изучить влияние предварительной инкубации Treg с этим цитокином на их супрессивную функцию.

Цель 2.А. Определите фенотип клеток iTreg у пациентов с РРС. Исследования с помощью проточной цитометрии клеток IL-10+CD4+ и TGF-B+CD4+, полученных от пациентов с RRMS и HCs, выявят специфический для заболевания фенотип iTreg, который может отражать функциональные изменения iTreg при RRMS. Исследователи изучат одни и те же образцы из когорты пациентов с RRMS и HC, включенных в Конкретную цель 1.A. Исследования проточной цитометрии гейтированных клеток CD4+IL-10+ и CD4+TGF-B+ будут выполняться с использованием поверхностного маркерного окрашивания для CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b и LAG-3 и внутриклеточного окрашивания для FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, репрессор GATA-3 (ROG), арилуглеводородный рецептор (AhR) и факторы транскрипции c-Maf.

Цель 2.Б. Определите механизмы дефицита nTreg индукции iTregs при RRMS.

Супрессивный анализ будет выполняться, как описано в цели 1.B, с использованием клеток CD4+CD25+CD127-Treg и CD4+CD25-CD127+ Teff, полученных из четвертой когорты из 10 пациентов с HCs и 10 пациентов с RRMS. Через 4 дня совместного культивирования CD25+ Treg-клетки будут удалены с помощью магнитных шариков, а оставшиеся CD4+CD25-клетки будут облучены и повторно высеяны в соотношении 1:10 с аутологичными CD4+CD25-Т-клетками и стимулированы планшетом. -иммобилизовали mAb aCD3 и aCD28 в течение дополнительных 5 дней, чтобы продемонстрировать подавляющий эффект iTreg. Клеточная пролиферация (измеряемая по включению 3[H]) и секреция TGF-β и IL-10 в SN будут измеряться для определения супрессивной функции iTreg, индуцированной CD4+CD25+CD127-Treg в эффекторных CD4+ клетках. Во втором совместном культивировании исследователи также изучат, в какой степени индукция iTreg опосредована межклеточным контактом (заблокированным проницаемой мембраной) или растворимыми цитокинами (заблокированными aIL-10, aTGF-B или aIL). -4 мАт).

Цель 2.С. Охарактеризовать влияние иммунорегуляторных цитокинов, продуцируемых iTreg, на восстановление иммунной толерантности.

Исследователи будут измерять уровни IFN-γ, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 и IL-10, TGF-B и IL-35 в SN вышеуказанных совместных культур. iTreg и клеток CD4+, полученных от пациентов с RRMS и HCs, через 48 часов. Исследователи измерят экспрессию MHC класса I и II, CD80, CD86, CD40 и CD58 в оставшихся образцах РВМС, полученных в рамках специальной цели 2B, у 10 пациентов с HCs и 10 пациентов с RRMS в CD19+-зависимых В-клетках, CD14+-зависимых моноцитах, и CD1c-зависимые DC с использованием проточной цитометрии, как сообщалось в нашем предыдущем исследовании 43. Исследователи изучат, в какой степени количество iTreg и продукция iTreg IL-10 и TGF-B, а также уровни IL-10 и TGF-B в сыворотке коррелируют с ингибированием MHC и экспрессии костимулирующих молекул в В-клетках, моноцитах и ДК у пациентов с ГХ и РРРС.