Función deficiente de las células T reguladoras (Treg) en pacientes con esclerosis múltiple remitente recurrente

El estudio inscribirá a 40 pacientes con RRMS (de 18 a 55 años, escala de estado de discapacidad ampliada (EDSS) de 0 a 6) y 40 controles saludables (HC) emparejados por edad, sexo y raza. Los sujetos del estudio se inscribirán en la clínica de EM de la Universidad Thomas Jefferson, que sirve como centro de referencia terciario.

Los criterios de inclusión son diagnóstico confirmado de RRMS de acuerdo con los criterios de diagnóstico de McDonald's12, edad 18-55 inclusive, puntaje de estado de discapacidad extendido (EDSS) 1.5-5.5 y sin terapia inmunomoduladora en el momento del estudio. El período libre de tratamiento será de al menos 4 semanas para metilprednisolona IV, interferón-beta, acetato de glatiramer, fingolimod, tecfidera y natalizumab. Los pacientes tratados previamente con terapias inmunosupresoras, que incluyen azatioprina, metotrexato, mitoxantrona y ciclofosfamida, no participarán en el estudio. Los criterios de exclusión incluirán infección concomitante, condición médica y psiquiátrica significativa a discreción del investigador principal. Las mujeres embarazadas y los pacientes que participan en otros ensayos de investigación no se inscribirán en este estudio. 40 controles sanos emparejados por edad, sexo y raza con el grupo de pacientes con EM RR se inscribirán en el estudio como grupo de control.

Objetivo 1. A. Identificar los cambios de fenotipo en CD4+CD25+CD127-nTregs en pacientes con EMRR.

El perfil transcripcional de CD4+CD25+CD127-Tregs ordenados se realizará utilizando RNAseq en la primera cohorte de 10 HC y 10 pacientes con RRMS. Las células Treg CD4+CD25+CD127- se separarán de las células CD4+ separadas por perlas magnéticas. El ADNc se generará utilizando el kit de ARN de entrada ultrabaja SMART-Seq v4 para secuenciación. La detección de genes expresados ​​diferencialmente entre pacientes con RRMS y células Treg derivadas de HC permitirá la caracterización funcional de las células Treg en RRMS. Los experimentos de secuenciación de ARN y el análisis de datos serán realizados por el Dr. Paolo Fortina y el Dr. Adam Ertel en TJU Sidney Kimmel Cancer Center. La expresión génica diferencial en RRMS Tregs identificada por RNAseq se confirmará mediante RT-PCR y transferencia Western.

Se utilizarán estudios de citometría de flujo utilizando muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la segunda cohorte de pacientes con HC y RRMS (10 donantes en cada grupo) para determinar los cambios en la expresión de los marcadores de proteína Treg en pacientes con RRMS. Los marcadores Treg individuales confieren mecanismos específicos de supresión. Para el perfil fenotípico integral de Treg, los investigadores determinarán el porcentaje de células positivas para CTLA-4, CD39, GZB, perforina, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, receptor de muerte programada (PD-1) y LAG3 dentro de las Treg activadas por CD4+CD25+CD127. La expresión de FOXP3, GZB y perforina se determinará mediante tinción intracelular, así como la secreción de citocinas TGF-B, IL-10 e IL-35 de Tregs, que pueden contribuir a su función supresora (2x106 PBMC por tinción de 14 colores).

Objetivo 1.B. Caracterizar el déficit funcional de nTregs en RRMS. Los ensayos de supresión funcional compararán la función supresora de Treg en una tercera cohorte de 10 pacientes con HC y 10 con RRMS.

La hipótesis es que los cocultivos Treg con células Teff de HC aumentarán la concentración de TGF-B, IL-10 e IL-35 y disminuirán las concentraciones de IFN-y e IL-17A en los sobrenadantes de cultivo (SN) en comparación con los ensayos de supresión usando células Treg y Teff de pacientes con EMRR. Para examinar la susceptibilidad de las células de Teff en pacientes con EMRR en comparación con los HC, los ensayos de supresión se realizarán en experimentos de diseño cruzado:

1. Células RMS Tregs+RRMS Teff
2. Células HC Tregs+HC Teff
3. Células RRMS Tregs+HC Teff
4. Células HC Tregs+RRMS Teff

Se cocultivarán 2x104 CD4+CD25+CD127-Tregs clasificados por condición con células autólogas CD4+CD25-CD127+ teñidas con CFSE de Teff en presencia de aCD3 (0,5 ug/ml) y aCD28 (1 ug/ml) mAb y 105 células presentadoras de antígeno irradiadas (PBMC - células CD4+) en proporciones de 1:1 y 1:10. Los investigadores medirán la proliferación a través de la dilución de CFSE en las células Teff y la secreción de citocinas en las SN de los cultivos celulares para determinar en qué medida las células Treg de los pacientes con RRMS muestran una disminución de la supresión en comparación con las HC. Las mediciones de citocinas IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B e IL-4 se realizarán mediante ELISA.

Objetivo 1.C. Determinar los efectos de IL-7 en la función supresora de nTregs en RRMS.

Dado que nuestros datos preliminares han identificado la fosforilación de STAT5 inducida por IL-7 y la expresión de FOXP3, así como la proliferación de Treg inducida por IL-7 in vitro, los investigadores correlacionarán los niveles séricos de IL-7 con los números de Treg (% de células CD4+ x número total de células) y su función supresora, y examinar el efecto de la preincubación de Tregs con esta citocina en su función supresora.

Objetivo 2.A. Determinar el fenotipo de las células iTreg en pacientes con EMRR. Los estudios de citometría de flujo de las células IL-10+CD4+ y TGF-B+CD4+ derivadas de pacientes con EMRR y HC identificarán el fenotipo específico de la enfermedad de iTregs, que puede reflejar cambios funcionales de iTregs en RRMS. Los investigadores examinarán las mismas muestras de la cohorte de pacientes con EMRR y HC inscritos en el objetivo específico 1.A. Los estudios de citometría de flujo de las células CD4+IL-10+ y CD4+TGF-B+ sincronizadas se realizarán mediante tinción de marcadores de superficie para CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b y LAG-3 y tinción intracelular para FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, el represor de GATA-3 (ROG), el receptor de arilo de hidrocarburos (AhR) y factores de transcripción c-Maf.

Objetivo 2.B. Identificar los mecanismos de inducción deficiente de nTreg de iTregs en RRMS.

Los ensayos de supresión se realizarán como se describe en el Objetivo 1.B usando células CD4+CD25+CD127-Treg y CD4+CD25-CD127+ Teff derivadas de la cuarta cohorte de 10 HC y 10 pacientes con RRMS. Después de 4 días de cocultivo, las células Treg CD25+ se eliminarán utilizando perlas magnéticas, y las células CD4+CD25- restantes se irradiarán y se volverán a sembrar en placa en una proporción de 1:10 con células T CD4+CD25- autólogas y se estimularán con placa. - mAb aCD3 y aCD28 inmovilizados durante 5 días adicionales para demostrar el efecto supresor de iTregs. Se medirá la proliferación celular (medida por la incorporación de 3[H]) y la secreción de TGF-β e IL-10 en los SN para determinar la función supresora de iTreg inducida por CD4+CD25+CD127- Tregs en las células efectoras CD4+. En el segundo cocultivo, los investigadores también examinarán en qué medida la inducción de iTreg está mediada por contacto de célula a célula (bloqueado por una membrana permeable) o por citocinas solubles (bloqueadas por aIL-10, aTGF-B o aIL -4mAb).

Objetivo 2.C. Caracterizar el efecto de las citoquinas inmunorreguladoras producidas por iTreg en la reconstitución de la tolerancia inmune.

Los investigadores medirán los niveles de IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 e IL-10, TGF-B e IL-35 en los SN de los cocultivos anteriores. de iTregs y células CD4+ derivadas de pacientes con EMRR y HC a las 48 h. Los investigadores medirán la expresión del MHC clase I y II, CD80, CD86, CD40 y CD58 en las muestras restantes de PBMC obtenidas en el objetivo específico 2B en 10 HC y 10 pacientes con RRMS en células B controladas por CD19+, monocitos controlados por CD14+, y DC activadas por CD1c mediante citometría de flujo, como se informó en nuestro estudio anterior 43. Los investigadores examinarán en qué medida los números de iTreg y la producción de IL-10 y TGF-B de iTregs, así como los niveles séricos de IL-10 y TGF-B se correlacionan con la inhibición de la expresión de MHC y moléculas coestimuladoras en células B, monocitos y DCs en HCs y pacientes RRMS.