재발 완화성 다발성 경화증 환자의 T 조절 세포(Treg) 기능 결핍

이 연구는 40명의 RRMS 환자(18-55세, 확장 장애 상태 척도(EDSS) 0-6)와 40명의 연령, 성별 및 인종 일치 건강한 대조군(HC)을 등록합니다. 연구 대상자는 3차 의뢰 센터 역할을 하는 Thomas Jefferson University MS 클리닉에 등록됩니다.

포함 기준은 맥도날드의 진단 기준12에 따라 RRMS 진단이 확인되고, 18-55세, 확장 장애 상태 점수(EDSS) 1.5-5.5, 연구 시점에 면역조절 요법이 없는 경우입니다. IV Methylprednisolone, Interferon-beta, Glatiramer acetate, Fingolimod, Tecfidera 및 Natalizumab의 경우 무치료 기간은 최소 4주입니다. 이전에 Azathioprine, Methotrexate, Mitoxantrone 및 Cyclophosphamide를 포함한 면역억제 요법으로 치료받은 환자는 연구에 등록되지 않습니다. 제외 기준에는 수반되는 감염, 주요 조사자의 재량에 따라 중요한 의학적 및 정신과적 상태가 포함됩니다. 임산부 및 다른 연구 시험에 참여하는 환자는 이 연구에 등록하지 않습니다. RR MS 환자 그룹과 연령, 성별 및 인종이 일치하는 40명의 건강한 대조군이 대조군으로 연구에 등록됩니다.

목표 1. A. RRMS 환자에서 CD4+CD25+CD127-nTregs의 표현형 변화를 확인합니다.

분류된 CD4+CD25+CD127- Treg의 전사 프로파일링은 10명의 HC 및 10명의 RRMS 환자의 첫 번째 코호트에서 RNAseq를 사용하여 수행될 것입니다. CD4+CD25+CD127- Treg 세포는 자기 비드 분리 CD4+ 세포에서 분류됩니다. 시퀀싱용 SMART-Seq v4 초저입력 RNA 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다. RRMS 환자와 HC 유래 Treg 세포 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자의 검출은 RRMS에서 Treg 세포의 기능적 특성화를 허용할 것입니다. RNA seq 실험 및 데이터 분석은 TJU Sidney Kimmel Cancer Center의 Paolo Fortina 박사와 Adam Ertel 박사가 수행할 예정입니다. RNAseq에 의해 확인된 RRMS Treg의 차등 유전자 발현은 RT-PCR 및 웨스턴 블롯팅을 통해 확인됩니다.

HC 및 RRMS 환자의 두 번째 코호트(각 그룹에 10명의 기증자)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플을 사용한 유세포 분석 연구는 RRMS 환자에서 Treg 단백질 마커의 발현 변화를 결정하는 데 사용될 것입니다. 개별 Treg 마커는 특정 억제 메커니즘을 부여합니다. 포괄적인 Treg 표현형 프로파일링을 위해 조사관은 CTLA-4, CD39, GZB, 퍼포린, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, 프로그래밍된 사멸 수용체(PD-1) 및 LAG3 양성 세포의 백분율을 결정합니다. CD4+CD25+CD127-게이트 Treg. FOXP3, GZB 및 퍼포린 발현은 억제 기능에 기여할 수 있는 Treg의 TGF-B, IL-10 및 IL-35 사이토카인 분비뿐만 아니라 세포내 염색을 사용하여 결정됩니다(14색 염색당 2x106 PBMC).

목표 1.B. RRMS에서 nTregs의 기능 적자를 특성화합니다. 기능적 억제 분석은 10명의 HC 및 10명의 RRMS 환자의 세 번째 코호트에서 Treg 억제 기능을 비교할 것입니다.

가설은 HC의 Teff 세포와 Treg 공동 배양이 TGF-B, IL-10 및 IL-35의 농도를 증가시키고 배양 상청액(SN)에서 IFN-γ 및 IL-17A의 농도를 감소시킬 것이라는 것입니다. RRMS 환자의 Treg 및 Teff 세포를 사용한 억제 분석. HC와 비교하여 RRMS 환자에서 Teff 세포의 감수성을 조사하기 위해 교차 설계 실험에서 억제 분석이 수행됩니다.

1. RMS Tregs+RRMS Teff 세포
2. HC Treg+HC Teff 세포
3. RRMS Treg+HC Teff 세포
4. HC Treg+RRMS Teff 세포

조건당 분류된 2x104 CD4+CD25+CD127- Treg는 aCD3(0.5ug/ml) 및 aCD28(1ug/ml) mAb 및 105 1:1 및 1:10 비율로 조사된 항원 제시 세포(PBMC - CD4+ 세포). 연구자들은 Teff 세포의 CFSE 희석을 통한 증식과 세포 배양의 SN에서 사이토카인 분비를 측정하여 RRMS 환자의 Treg 세포가 HC와 비교하여 감소된 억제를 나타내는 정도를 결정할 것입니다. IFN-γ, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B 및 IL-4 사이토카인 측정은 ELISA를 사용하여 수행됩니다.

목표 1.C. RRMS에서 nTregs의 억제 기능에 대한 IL-7의 효과를 결정합니다.

우리의 예비 데이터에서 IL-7 유도 STAT5 인산화 및 FOXP3 발현뿐만 아니라 IL-7 체외 유도 Treg 증식을 확인했기 때문에 연구자들은 혈청 IL-7 수준을 Treg 수치(CD4+ 세포의 % x 총 세포 수) 및 이들의 억제 기능을 조사하고, 이 사이토카인과 함께 Treg의 사전 배양이 이들의 억제 기능에 미치는 영향을 조사합니다.

목표 2.A. RRMS 환자에서 iTreg 세포의 표현형을 결정합니다. RRMS 환자 및 HC에서 파생된 IL-10+CD4+ 및 TGF-B+CD4+ 세포의 유세포 분석 연구는 RRMS에서 iTregs의 기능적 변화를 반영할 수 있는 iTregs의 질병 특이적 표현형을 식별할 것입니다. 조사관은 특정 목표 1.A에 등록된 RRMS 환자 및 HC 집단의 동일한 샘플을 검사합니다. 게이팅된 CD4+IL-10+ 및 CD4+TGF-B+ 세포의 유세포 분석 연구는 CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b 및 LAG-3에 대한 표면 마커 염색 및 FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, GATA-3(ROG)의 억제자, 아릴 탄화수소 수용체(AhR) 및 c-Maf 전사 인자.

목표 2.B. RRMS에서 iTregs의 nTreg 결핍 유도 메커니즘을 확인합니다.

억제 분석은 10명의 HC 및 10명의 RRMS 환자의 네 번째 코호트에서 파생된 CD4+CD25+CD127-Treg 및 CD4+CD25-CD127+ Teff 세포를 사용하여 목표 1.B에 설명된 대로 수행됩니다. 공동 배양 4일 후, 자기 비드를 사용하여 CD25+ Treg 세포를 제거하고, 나머지 CD4+CD25- 세포를 조사하고 자가 CD4+CD25- T 세포와 1:10 비율로 재도금하고, 플레이트로 자극합니다. - iTregs의 억제 효과를 입증하기 위해 추가 5일 동안 aCD3 및 aCD28 mAb를 고정화했습니다. 세포 증식(3[H] 혼입에 의해 측정됨) 및 SN에서의 TGF-β 및 IL-10 분비를 측정하여 이펙터 CD4+ 세포에서 CD4+CD25+CD127-Treg에 의해 유도된 iTreg 억제 기능을 결정할 것이다. 두 번째 공동 배양에서 조사관은 iTreg 유도가 세포 간 접촉(투과성 막에 의해 차단됨) 또는 수용성 사이토카인(aIL-10, aTGF-B 또는 aIL에 의해 차단됨)을 통해 어느 정도까지 매개되는지 검사할 것입니다. -4mAb).

목표 2.C. 면역 관용의 재구성에 대한 iTreg 생산 면역 조절 사이토카인의 효과를 특성화합니다.

조사자는 위의 공동 배양의 SN에서 IFN-γ, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 및 IL-10, TGF-B 및 IL-35 수준을 측정합니다. RRMS 환자 및 HC에서 파생된 iTregs 및 CD4+ 세포의 48시간. 연구자들은 CD19+-개폐 B 세포, CD14+-개폐 단핵구, 이전 연구 43에서 보고된 바와 같이 유동 세포측정법을 사용하는 CD1c-게이트 DC. 연구자들은 iTreg 수치와 iTregs의 IL-10 및 TGF-B 생산, IL-10 및 TGF-B 혈청 수준이 B 세포, 단핵구 및 HC 및 RRMS 환자의 DC.