复发缓解型多发性硬化症患者的 T 调节细胞 (Treg) 功能缺陷

该研究将招募 40 名 RRMS 患者（年龄 18-55 岁，扩展残疾状态量表 (EDSS) 0-6）和 40 名年龄、性别和种族匹配的健康对照者 (HC)。 研究对象将在托马斯杰斐逊大学 MS 诊所注册，该诊所作为三级转诊中心。

纳入标准是根据麦当劳诊断标准 12 确诊 RRMS，年龄 18-55 岁（含），扩展残疾状态评分 (EDSS) 1.5-5.5，并且在研究期间未接受免疫调节治疗。 IV 甲泼尼龙、干扰素-β、醋酸格拉替雷、芬戈莫德、Tecfidera 和那他珠单抗的无治疗期至少为 4 周。 以前接受过免疫抑制疗法（包括硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌和环磷酰胺）治疗的患者将不会参加该研究。 排除标准将包括由主要研究者酌情决定的伴随感染、重大医学和精神状况。 孕妇和参加其他研究试验的患者将不会参加本研究。 将年龄、性别和种族与 RR MS 患者组匹配的 40 名健康对照作为对照组参加研究。

目标 1. A. 识别 RRMS 患者中 CD4+CD25+CD127- nTregs 的表型变化。

分选的 CD4+CD25+CD127- Tregs 的转录谱分析将在第一批 10 名 HC 和 10 名 RRMS 患者中使用 RNAseq 进行。 CD4+CD25+CD127- Treg 细胞将从磁珠分离的 CD4+ 细胞中分选出来。 cDNA 将使用用于测序的 SMART-Seq v4 超低输入 RNA 试剂盒生成。 检测 RRMS 患者和 HC 衍生的 Treg 细胞之间的差异表达基因将允许对 RRMS 中的 Treg 细胞进行功能表征。 RNA seq 实验和数据分析将由 TJU Sidney Kimmel 癌症中心的 Paolo Fortina 博士和 Adam Ertel 博士进行。 RNAseq 鉴定的 RRMS Tregs 中的差异基因表达将通过 RT-PCR 和蛋白质印迹法得到证实。

使用来自第二组 HC 和 RRMS 患者（每组 10 名供体）的外周血单核细胞 (PBMC) 样本的流式细胞术研究将用于确定 RRMS 患者中 Treg 蛋白标记物表达的变化。 个别 Treg 标记赋予特定的抑制机制。 对于全面的 Treg 表型分析，研究人员将确定 CTLA-4、CD39、GZB、穿孔素、GITR、OX40、HLADR、TNFR2、Tim-3、程序性死亡受体 (PD-1) 和 LAG3 阳性细胞的百分比CD4+CD25+CD127——门控 Tregs。 FOXP3、GZB 和穿孔素表达将使用细胞内染色以及 Tregs 的 TGF-B、IL-10 和 IL-35 细胞因子分泌来确定，这可能有助于它们的抑制功能（每 14 种颜色染色 2x106 个 PBMC）。

目标 1.B. 表征 RRMS 中 nTregs 的功能缺陷。 功能抑制试验将比较第三组 10 名 HC 和 10 名 RRMS 患者的 Treg 抑制功能。

假设是 Treg 与来自 HCs 的 Teff 细胞共培养将增加 TGF-B、IL-10 和 IL-35 的浓度，并降低培养物上清液 (SN) 中的 IFN-γ 和 IL-17A 的浓度使用来自 RRMS 患者的 Treg 和 Teff 细胞的抑制试验。 为了检查 RRMS 患者中 Teff 细胞与 HC 相比的易感性，将在交叉设计实验中进行抑制测定：

1. RMS Tregs+RRMS Teff 细胞
2. HC Tregs+HC Teff细胞
3. RRMS Tregs+HC Teff细胞
4. HC Tregs+RRMS Teff细胞

在 aCD3 (0.5 ug/ml) 和 aCD28 (1 ug/ml) mAb 和 105以 1:1 和 1:10 的比例照射的抗原呈递细胞（PBMC - CD4+ 细胞）。 研究人员将通过 Teff 细胞中的 CFSE 稀释和细胞培养物 SN 中的细胞因子分泌来测量增殖，以确定与 HC 相比，RRMS 患者的 Treg 细胞在多大程度上表现出抑制减少。 IFN-γ、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-10、TGF-B 和 IL-4 细胞因子测量将使用 ELISA 进行。

目标 1.C. 确定 IL-7 对 RRMS 中 nTregs 抑制功能的影响。

由于我们的初步数据已经确定了 IL-7 诱导的 STAT5 磷酸化和 FOXP3 表达，以及 IL-7 体外诱导的 Treg 增殖，因此研究人员将血清 IL-7 水平与 Treg 数量（CD4+ 细胞的百分比 x细胞总数）及其抑制功能，并检查Tregs与该细胞因子预孵育对其抑制功能的影响。

目标 2.A.确定 RRMS 患者 iTreg 细胞的表型。 来自 RRMS 患者和 HC 的 IL-10+CD4+ 和 TGF-B+CD4+ 细胞的流式细胞术研究将鉴定 iTregs 的疾病特异性表型，这可能反映 RRMS 中 iTregs 的功能变化。 调查人员将检查来自特定目标 1.A 中注册的 RRMS 患者和 HC 队列的相同样本。门控 CD4+IL-10+ 和 CD4+TGF-B+ 细胞的流式细胞术研究将使用 CD39、CTLA-4、PD-1、ICOS、CD46、CD49b 和 LAG-3 的表面标记染色以及细胞内染色FOXP3、IL-35、GZMB、pSTAT3、GATA-3 (ROG) 的阻遏物、芳烃受体 (AhR) 和 c-Maf 转录因子。

目标 2.B. 确定 RRMS 中 iTregs 缺陷 nTreg 诱导的机制。

抑制测定将按照目标 1.B 中的描述进行，使用来自第四组 10 名 HC 和 10 名 RRMS 患者的 CD4+CD25+CD127-Treg 和 CD4+CD25-CD127+ Teff 细胞。 共培养 4 天后，使用磁珠去除 CD25+ Treg 细胞，将剩余的 CD4+CD25- 细胞照射并与自体 CD4+CD25- T 细胞以 1:10 的比例重新接种，并通过平板刺激-再固定 aCD3 和 aCD28 mAb 5 天，以证明 iTregs 的抑制作用。 将测量 SN 中的细胞增殖（通过 3[H] 掺入测量）和 TGF-β 和 IL-10 分泌，以确定效应 CD4+ 细胞中 CD4+CD25+CD127-Treg 诱导的 iTreg 抑制功能。 在第二次共培养中，研究人员还将检查 iTreg 诱导在多大程度上是通过细胞间接触（被渗透膜阻断）或可溶性细胞因子（被 aIL-10、aTGF-B 或 aIL 阻断）介导的-4 单克隆抗体）。

目标 2.C. 表征 iTreg 产生的免疫调节细胞因子对免疫耐受重建的影响。

研究人员将测量上述共培养物 SN 中的 IFN-γ、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-9 和 IL-10、TGF-B 和 IL-35 水平48 小时时来自 RRMS 患者和 HC 的 iTregs 和 CD4+ 细胞。 研究人员将测量 Specific Aim 2B 中 10 名 HC 和 10 名 RRMS 患者在 CD19+ 门控 B 细胞、CD14+ 门控单核细胞中获得的剩余 PBMC 样本中 MHC I 类和 II 类、CD80、CD86、CD40 和 CD58 的表达，和 CD1c 门控 DC 使用流式细胞术，正如我们之前的研究 43 中所报道的。 研究人员将检查 iTreg 数量和 iTreg 的 IL-10 和 TGF-B 产生以及 IL-10 和 TGF-B 血清水平在多大程度上与 B 细胞、单核细胞和细胞中 MHC 和共刺激分子表达的抑制相关。 HC 和 RRMS 患者中的 DC。