Deficit della funzione delle cellule T regolatorie (Treg) nei pazienti con sclerosi multipla recidivante-remittente

Lo studio arruolerà 40 pazienti RRMS (età 18-55, scala ampliata dello stato di disabilità (EDSS) 0-6) e 40 controlli sani (HC) abbinati per età, sesso e razza. I soggetti dello studio saranno arruolati presso la clinica per la SM della Thomas Jefferson University, che funge da centro di riferimento terziario.

I criteri di inclusione sono la diagnosi confermata di SMRR secondo i criteri diagnostici di McDonald's12, età compresa tra 18 e 55 anni, punteggio esteso dello stato di disabilità (EDSS) 1,5-5,5 e nessuna terapia immunomodulante al momento dello studio. Il periodo libero dal trattamento sarà di almeno 4 settimane per Metilprednisolone IV, Interferone-beta, Glatiramer acetato, Fingolimod, Tecfidera e Natalizumab. I pazienti precedentemente trattati con terapie immunosoppressive, tra cui azatioprina, metotrexato, mitoxantrone e ciclofosfamide non saranno arruolati nello studio. I criteri di esclusione includeranno infezione concomitante, condizione medica e psichiatrica significativa a discrezione del ricercatore principale. Le donne in gravidanza e i pazienti che partecipano ad altri studi di ricerca non saranno arruolati in questo studio. 40 controlli sani abbinati per età, sesso e razza con il gruppo di pazienti con SM RR saranno arruolati nello studio come gruppo di controllo.

Obiettivo 1. A. Identificare i cambiamenti fenotipici nei CD4+CD25+CD127-nTreg nei pazienti con SMRR.

Il profilo trascrizionale delle Treg CD4+CD25+CD127-ordinate sarà eseguito utilizzando RNAseq nella prima coorte di 10 pazienti con HC e 10 con RRMS. Le cellule Treg CD4+CD25+CD127- saranno separate da cellule CD4+ separate da biglie magnetiche. Il cDNA verrà generato utilizzando il kit di RNA a input ultra basso SMART-Seq v4 per il sequenziamento. L'individuazione di geni differenzialmente espressi tra i pazienti RRMS e le cellule Treg derivate da HC consentirà la caratterizzazione funzionale delle cellule Treg nella SMRR. Gli esperimenti di RNA seq e l'analisi dei dati saranno eseguiti dal Dr. Paolo Fortina e dal Dr. Adam Ertel presso il TJU Sidney Kimmel Cancer Center. L'espressione genica differenziale nelle Treg RRMS identificate da RNAseq sarà confermata mediante RT-PCR e western blotting.

Gli studi di citometria a flusso utilizzando i campioni di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dalla seconda coorte di pazienti con HC e RRMS (10 donatori in ciascun gruppo) saranno utilizzati per determinare i cambiamenti nell'espressione dei marcatori proteici Treg nei pazienti con RRMS. I singoli marcatori Treg conferiscono specifici meccanismi di soppressione. Per il profilo fenotipico completo di Treg, gli investigatori determineranno la percentuale di CTLA-4, CD39, GZB, perforina, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, recettore della morte programmata (PD-1) e cellule LAG3-positive all'interno le Treg CD4+CD25+CD127. L'espressione di FOXP3, GZB e perforina sarà determinata mediante colorazione intracellulare, così come la secrezione di citochine TGF-B, IL-10 e IL-35 di Tregs, che possono contribuire alla loro funzione soppressiva (2x106 PBMC per 14 colorazioni).

Obiettivo 1.B. Caratterizzare il deficit funzionale di nTregs in RRMS. I test di soppressione funzionale confronteranno la funzione soppressiva delle Treg in una terza coorte di 10 pazienti con HC e 10 con RRMS.

L'ipotesi è che le co-colture di Treg con cellule Teff da HC aumenteranno la concentrazione di TGF-B, IL-10 e IL-35 e ridurranno le concentrazioni di IFN-y e IL-17A nei surnatanti di coltura (SN) rispetto a i test di soppressione utilizzando cellule Treg e Teff da pazienti con RRMS. Al fine di esaminare la suscettibilità delle cellule Teff nei pazienti RRMS rispetto agli HC, i test di soppressione saranno eseguiti in esperimenti di progettazione incrociata:

1. Treg RMS+celle Teff RMS
2. Cellule HC Treg + HC Teff
3. Cellule RRMS Treg+HC Teff
4. Cellule HC Treg + RRMS Teff

2x104 CD4+CD25+CD127- Treg ordinate per condizione saranno co-coltivate con cellule CD4+CD25-CD127+ autologhe colorate con Teff CFSE in presenza di aCD3 (0,5 ug/ml) e aCD28 (1 ug/ml) mAb e 105 cellule presentanti l'antigene irradiate (PBMC - cellule CD4+) in rapporto 1:1 e 1:10. Gli investigatori misureranno la proliferazione tramite la diluizione CFSE nelle cellule Teff e la secrezione di citochine nelle SN delle colture cellulari per determinare fino a che punto le cellule Treg dei pazienti RRMS mostrano una ridotta soppressione rispetto agli HC. Le misure delle citochine di IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B e IL-4 saranno eseguite mediante ELISA.

Obiettivo 1.C. Determinare gli effetti di IL-7 sulla funzione soppressiva dei nTregs in RRMS.

Poiché i nostri dati preliminari hanno identificato la fosforilazione di STAT5 indotta da IL-7 e l'espressione di FOXP3, così come la proliferazione di Treg indotta in vitro da IL-7, i ricercatori correleranno i livelli sierici di IL-7 con i numeri di Treg (% di cellule CD4+ x numero totale di cellule) e la loro funzione soppressiva ed esaminare l'effetto della pre-incubazione delle Treg con questa citochina sulla loro funzione soppressiva.

Obiettivo 2.A. Determinare il fenotipo delle cellule iTreg nei pazienti con SMRR. Gli studi di citometria a flusso delle cellule IL-10+CD4+ e TGF-B+CD4+ derivate da pazienti con RRMS e HC identificheranno il fenotipo specifico della malattia di iTreg, che può riflettere i cambiamenti funzionali di iTreg in RRMS. Gli investigatori esamineranno gli stessi campioni dalla coorte di pazienti con RRMS e HC arruolati nell'obiettivo specifico 1.A. Gli studi di citometria a flusso delle cellule gated CD4+IL-10+ e CD4+TGF-B+ saranno eseguiti utilizzando marcatori di superficie per CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b e LAG-3 e colorazione intracellulare per FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, il repressore di GATA-3 (ROG), il recettore degli idrocarburi arilici (AhR) e fattori di trascrizione c-Maf.

Obiettivo 2.B. Identificare i meccanismi di induzione nTreg carente di iTregs in RRMS.

I saggi soppressivi saranno eseguiti come descritto nell'Obiettivo 1.B utilizzando cellule CD4+CD25+CD127-Treg e CD4+CD25-CD127+ Teff derivate dalla quarta coorte di 10 pazienti con HC e 10 con RRMS. Dopo 4 giorni di co-coltura, le cellule Treg CD25+ saranno rimosse usando biglie magnetiche, e le restanti cellule CD4+CD25- saranno irradiate e ripiastrate con un rapporto 1:10 con cellule T autologhe CD4+CD25-, e stimolate mediante piastra - immobilizzato aCD3 e aCD28 mAb per altri 5 giorni per dimostrare l'effetto soppressivo di iTregs. La proliferazione cellulare (misurata dall'incorporazione di 3[H]) e la secrezione di TGF-β e IL-10 nelle SNs saranno misurate per determinare la funzione soppressiva iTreg indotta da CD4+CD25+CD127-Treg nelle cellule effettrici CD4+. Nella seconda co-coltura, i ricercatori esamineranno anche fino a che punto l'induzione di iTreg è mediata dal contatto cellula-cellula (bloccato da una membrana permeabile) o da citochine solubili (bloccate da aIL-10, aTGF-B o aIL -4 mAb).

Obiettivo 2.C. Caratterizzare l'effetto delle citochine immunoregolatorie prodotte da iTreg sulla ricostituzione della tolleranza immunitaria.

Gli investigatori misureranno i livelli di IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 e IL-10, TGF-B e IL-35 nelle SN delle suddette co-colture di iTregs e cellule CD4 + derivate da pazienti con RRMS e HC a 48 ore. Gli investigatori misureranno l'espressione di MHC di classe I e II, CD80, CD86, CD40 e CD58 nei restanti campioni di PBMC ottenuti nell'obiettivo specifico 2B in 10 pazienti con HC e 10 RRMS in cellule B CD19+, monociti CD14+, e CD1c-gated DC utilizzando la citometria a flusso, come riportato nel nostro precedente studio 43. Gli investigatori esamineranno fino a che punto i numeri di iTreg e la produzione di IL-10 e TGF-B di iTregs, così come i livelli sierici di IL-10 e TGF-B sono correlati con l'inibizione dell'espressione di molecole MHC e costimolatorie in cellule B, monociti e CD nei pazienti con HC e RRMS.