Mangelfull T Regulatory Cell (Treg) funksjon hos pasienter med residiverende remitterende multippel sklerose

Studien vil inkludere 40 RRMS-pasienter (alder 18-55, utvidet funksjonshemmingsstatusskala (EDSS) 0-6), og 40 alders-, kjønns- og rasematchede Healthy Controls (HCs). Studiefagene vil bli registrert ved Thomas Jefferson University MS-klinikken, som fungerer som et tertiært henvisningssenter.

Inklusjonskriteriene er bekreftet diagnose av RRMS i henhold til McDonald's diagnostiske kriterier12, alder 18-55 inklusive, utvidet funksjonshemmingsstatus (EDSS) 1,5-5,5, og ingen immunmodulerende terapi på studietidspunktet. Behandlingsfri periode vil være minst 4 uker for IV Metylprednisolon, Interferon-beta, Glatirameracetat, Fingolimod, Tecfidera og Natalizumab. Pasienter som tidligere er behandlet med immunsuppressive terapier, inkludert azatioprin, metotreksat, mitoksantron og cyklofosfamid, vil ikke bli inkludert i studien. Eksklusjonskriterier vil inkludere samtidig infeksjon, betydelig medisinsk og psykiatrisk tilstand etter hovedetterforskers skjønn. Gravide kvinner og pasienter som deltar i andre forskningsstudier vil ikke bli registrert i denne studien. 40 friske kontroller matchet for alder, kjønn og rase med gruppen av RR MS-pasienter vil bli registrert i studien som en kontrollgruppe.

Mål 1. A. Identifisere fenotypeendringene i CD4+CD25+CD127-nTregs hos RRMS-pasienter.

Transkripsjonsprofilering av sorterte CD4+CD25+CD127-Tregs vil bli utført ved bruk av RNAseq i den første kohorten av 10 HC-er og 10 RRMS-pasienter. CD4+CD25+CD127- Treg-celler vil bli sortert fra magnetiske perler separerte CD4+-celler. cDNA vil bli generert ved hjelp av SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing. Påvisningen av differensielt uttrykte gener mellom RRMS-pasienter og HC-avledede Treg-celler vil tillate funksjonell karakterisering av Treg-celler i RRMS. RNA-seq-eksperimentene og dataanalysen vil bli utført av Dr. Paolo Fortina og Dr. Adam Ertel ved TJU Sidney Kimmel Cancer Center. Det differensielle genuttrykket i RRMS Tregs identifisert av RNAseq vil bli bekreftet via RT-PCR og western blotting.

Flowcytometristudier som bruker prøver av perifert blod mononukleære celle (PBMC) fra den andre kohorten av HC-er og RRMS-pasienter (10 donorer i hver gruppe) vil bli brukt til å bestemme endringer i uttrykket av Treg-proteinmarkørene hos RRMS-pasienter. Individuelle Treg-markører gir spesifikke mekanismer for undertrykkelse. For den omfattende Treg-fenotypiske profileringen vil etterforskerne bestemme prosentandelen av CTLA-4, CD39, GZB, perforin, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, programmert dødsreseptor (PD-1) og LAG3-positive celler i CD4+CD25+CD127--gatede tregs. FOXP3, GZB og perforinekspresjon vil bli bestemt ved bruk av intracellulær farging, samt Tregs' TGF-B, IL-10 og IL-35 cytokinsekresjon, som kan bidra til deres undertrykkende funksjon (2x106 PBMCs per 14 fargefarging).

Mål 1.B. Karakteriser det funksjonelle underskuddet til nTregs i RRMS. Funksjonelle suppresjonsanalyser vil sammenligne Treg-undertrykkende funksjon i en tredje kohort på 10 HC- og 10 RRMS-pasienter.

Hypotesen er at Treg-kokulturer med Teff-celler fra HC-er vil øke konsentrasjonen av TGF-B, IL-10 og IL-35 og redusere konsentrasjonene av IFN-y og IL-17A i kultursupernatanter (SN-er) i forhold til suppresjonsanalysene ved bruk av Treg- og Teff-celler fra RRMS-pasienter. For å undersøke følsomheten til Teff-celler hos RRMS-pasienter sammenlignet med HC-er, vil suppresjonsanalysene bli utført i et cross-over-designeksperiment:

1. RMS Tregs+RRMS Teff-celler
2. HC Tregs+HC Teff-celler
3. RRMS Tregs+HC Teff-celler
4. HC Tregs+RRMS Teff-celler

Sorterte 2x104 CD4+CD25+CD127- Tregs per tilstand vil bli dyrket sammen med autologe Teff CFSE-fargede CD4+CD25-CD127+-celler i nærvær av aCD3 (0,5 ug/ml) og aCD28 (1 ug/ml) mAb og 105 bestrålte antigenpresenterende celler (PBMCs - CD4+-celler) i forholdet 1:1 og 1:10. Etterforskerne vil måle spredning via CFSE-fortynning i Teff-cellene og cytokinsekresjon i SN-ene til cellekulturer for å bestemme i hvilken grad Treg-celler fra RRMS-pasienter viser redusert undertrykkelse sammenlignet med HC-er. IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B og IL-4 cytokinmålingene vil bli utført ved bruk av ELISA.

Mål 1.C. Bestem effekten av IL-7 på nTregs 'undertrykkende funksjon i RRMS.

Siden våre foreløpige data har identifisert IL-7-indusert STAT5-fosforylering og FOXP3-ekspresjon, samt IL-7 in-vitro-indusert Treg-proliferasjon, vil etterforskerne korrelere serum-IL-7-nivåene med Treg-tallene (% av CD4+-celler x totalt antall celler) og deres undertrykkende funksjon, og undersøk effekten av pre-inkubasjon av Tregs med dette cytokinet til deres undertrykkende funksjon.

Mål 2.A. Bestem fenotypen til iTreg-celler hos RRMS-pasienter. Flowcytometristudier av IL-10+CD4+- og TGF-B+CD4+-cellene avledet fra RRMS-pasienter og HC-er vil identifisere sykdomsspesifikk fenotype av iTregs, som kan reflektere funksjonelle endringer av iTregs i RRMS. Etterforskere vil undersøke de samme prøvene fra kohort av RRMS-pasienter og HC-er som er registrert i spesifikt mål 1.A. Flowcytometristudier av de gatede CD4+IL-10+- og CD4+TGF-B+-cellene vil bli utført ved bruk av overflatemarkørfarging for CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b og LAG-3 og intracellulær farging for FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, repressoren til GATA-3 (ROG), arylhydrokarbonreseptoren (AhR) og c-Maf-transkripsjonsfaktorer.

Mål 2.B. Identifiser mekanismene for mangelfull nTreg-induksjon av iTregs i RRMS.

Undertrykkende analyser vil bli utført som beskrevet i mål 1.B ved bruk av CD4+CD25+CD127-Treg og CD4+CD25-CD127+ Teff-celler avledet fra den fjerde kohorten på 10 HC-er og 10 RRMS-pasienter. Etter 4 dager med samkultur vil CD25+ Treg-celler bli fjernet ved hjelp av magnetiske perler, og de gjenværende CD4+CD25-cellene vil bli bestrålet og utplatet på nytt i et 1:10-forhold med autologe CD4+CD25-T-celler, og stimulert av plate. -immobiliserte aCD3 og aCD28 mAb i ytterligere 5 dager for å demonstrere den undertrykkende effekten av iTregs. Celleproliferasjon (målt ved 3[H]-inkorporering) og TGF-β og IL-10-sekresjon i SN-ene vil bli målt for å bestemme den iTreg-undertrykkende funksjonen indusert av CD4+CD25+CD127-Tregs i effektor-CD4+-cellene. I den andre samkulturen vil etterforskerne også undersøke i hvilken grad iTreg-induksjonen medieres via celle-til-celle-kontakt (blokkert av en permeabel membran) eller av løselige cytokiner (blokkert av aIL-10, aTGF-B eller aIL) -4 mAb).

Mål 2.C. Karakteriser effekten av de iTreg-produserte immunregulatoriske cytokinene på rekonstituering av immuntoleranse.

Etterforskere vil måle IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 og IL-10, TGF-B og IL-35-nivåene i SN-ene til de ovennevnte samkulturene av iTregs og CD4+-celler avledet fra RRMS-pasienter og HCs etter 48 timer. Etterforskerne vil måle uttrykket av MHC klasse I og II, CD80, CD86, CD40 og CD58 i de gjenværende PBMC-prøvene oppnådd i Spesifikt Aim 2B i 10 HC-er og 10 RRMS-pasienter i CD19+-gatede B-celler, CD14+-gatede monocytter, og CD1c-gatede DC-er ved bruk av flowcytometri, som rapportert i vår forrige studie 43. Etterforskerne skal undersøke i hvilken grad iTreg-tall og iTregs' IL-10- og TGF-B-produksjon, samt IL-10- og TGF-B-serumnivåer korrelerer med hemming av MHC og costimulatoriske molekylers uttrykk i B-celler, monocytter og DCs i HCs og RRMS-pasienter.