Deficientní funkce T regulačních buněk (Treg) u pacientů s recidivující-remitující roztroušenou sklerózou

Do studie bude zařazeno 40 pacientů s RRMS (věk 18-55, rozšířená stupnice stavu postižení (EDSS) 0-6) a 40 zdravých kontrol (HCs) odpovídajících věku, pohlaví a rase. Předměty studie budou zapsány na MS klinice Thomas Jefferson University, která slouží jako terciární referenční centrum.

Kritéria pro zařazení do studie jsou potvrzená diagnóza RRMS podle diagnostických kritérií McDonald's12, věk 18–55 včetně, skóre rozšířeného stavu postižení (EDSS) 1,5–5,5 a žádná imunomodulační léčba v době studie. Období bez léčby bude nejméně 4 týdny pro IV Methylprednisolon, Interferon-beta, Glatiramer acetát, Fingolimod, Tecfidera a Natalizumab. Do studie nebudou zařazeni pacienti dříve léčení imunosupresivními terapiemi, včetně azathioprinu, methotrexátu, mitoxantronu a cyklofosfamidu. Kritéria vyloučení budou zahrnovat souběžnou infekci, významný zdravotní a psychiatrický stav podle uvážení hlavního zkoušejícího. Těhotné ženy a pacienti účastnící se jiných výzkumných studií nebudou do této studie zařazeni. 40 zdravých kontrol odpovídajících věku, pohlaví a rase se skupinou pacientů s RR MS bude zahrnuto do studie jako kontrolní skupina.

Cíl 1. A. Identifikovat změny fenotypu u CD4+CD25+CD127- nTregs u pacientů s RRMS.

Transkripční profilování tříděných CD4+CD25+CD127- Tregs bude provedeno pomocí RNAseq v první kohortě 10 pacientů s HC a 10 pacientů s RRMS. Buňky CD4+CD25+CD127- Treg budou vytříděny z buněk CD4+ separovaných magnetickými kuličkami. cDNA bude generována pomocí soupravy SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit pro sekvenování. Detekce odlišně exprimovaných genů mezi pacienty s RRMS a buňkami Treg odvozenými od HC umožní funkční charakterizaci buněk Treg v RRMS. Experimenty RNA seq a analýzu dat provedou Dr. Paolo Fortina a Dr. Adam Ertel v TJU Sidney Kimmel Cancer Center. Rozdílná genová exprese v RRMS Tregs identifikovaná pomocí RNAseq bude potvrzena pomocí RT-PCR a western blottingu.

Studie průtokové cytometrie s použitím vzorků mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) od druhé kohorty pacientů s HC a RRMS (10 dárců v každé skupině) budou použity ke stanovení změn v expresi proteinových markerů Treg u pacientů s RRMS. Jednotlivé Treg markery udělují specifické mechanismy suprese. Pro komplexní Treg fenotypové profilování vyšetřovatelé určí procento CTLA-4, CD39, GZB, perforinu, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, receptoru programované smrti (PD-1) a LAG3-pozitivních buněk uvnitř CD4+CD25+CD127--gated Tregs. Exprese FOXP3, GZB a perforinu bude stanovena pomocí intracelulárního barvení, stejně jako sekrece cytokinů Tregs' TGF-B, IL-10 a IL-35, které mohou přispívat k jejich supresivní funkci (2x106 PBMC na 14 barevných barvení).

Cíl 1.B. Charakterizujte funkční deficit nTregs u RRMS. Testy funkční suprese budou porovnávat supresivní funkci Treg ve třetí kohortě 10 pacientů s HC a 10 pacientů s RRMS.

Hypotézou je, že společné kultury Treg s Teff buňkami z HC zvýší koncentraci TGF-B, IL-10 a IL-35 a sníží koncentrace IFN-y a IL-17A v supernatantech kultur (SN) ve srovnání s supresní testy s použitím buněk Treg a Teff od pacientů s RRMS. Aby bylo možné prozkoumat citlivost buněk Teff u pacientů s RRMS ve srovnání s HC, supresní testy budou provedeny v experimentech typu cross-over:

1. RMS Tregs+RRMS Teff články
2. HC Tregs+HC Teff články
3. RRMS Tregs+HC Teff buňky
4. HC Tregs+RRMS Teff články

Roztříděných 2x104 CD4+CD25+CD127- Tregs za podmínek bude společně kultivováno s autologními buňkami CD4+CD25-CD127+ obarvenými Teff CFSE v přítomnosti aCD3 (0,5 ug/ml) a aCD28 (1 ug/ml) mAb a 105 ozářených buněk prezentujících antigen (PBMC - CD4+ buňky) v poměrech 1:1 a 1:10. Výzkumníci budou měřit proliferaci prostřednictvím ředění CFSE v buňkách Teff a sekreci cytokinů v SN buněčných kultur, aby určili, do jaké míry buňky Treg od pacientů s RRMS vykazují sníženou supresi ve srovnání s HC. Měření IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B a IL-4 cytokinů bude provedeno pomocí ELISA.

Cíl 1.C. Určete účinky IL-7 na supresivní funkci nTregs v RRMS.

Protože naše předběžná data identifikovala IL-7-indukovanou fosforylaci STAT5 a expresi FOXP3, stejně jako IL-7 in vitro indukovanou proliferaci Treg, vědci budou korelovat hladiny IL-7 v séru s čísly Treg (% CD4+ buněk x celkový počet buněk) a jejich supresivní funkci a zkoumat vliv preinkubace Tregs s tímto cytokinem na jejich supresivní funkci.

Cíl 2.A. Určete fenotyp buněk iTreg u pacientů s RRMS. Studie průtokové cytometrie buněk IL-10+CD4+ a TGF-B+CD4+ odvozených od pacientů s RRMS a HC budou identifikovat fenotyp iTregs specifický pro onemocnění, který může odrážet funkční změny iTregs v RRMS. Vyšetřovatelé budou zkoumat stejné vzorky z kohorty pacientů s RRMS a HC zařazených do specifického cíle 1.A. Studie průtokové cytometrie gated CD4+IL-10+ a CD4+TGF-B+ buněk budou provedeny za použití povrchového markerového barvení pro CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b a LAG-3 a intracelulárního barvení pro FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, represor GATA-3 (ROG), aryl uhlovodíkový receptor (AhR) a transkripční faktory c-Maf.

Cíl 2.B. Identifikujte mechanismy nedostatečné nTreg indukce iTregs v RRMS.

Supresivní testy budou provedeny tak, jak je popsáno v cíli 1.B s použitím CD4+CD25+CD127-Treg a CD4+CD25-CD127+ Teff buněk odvozených ze čtvrté kohorty 10 HC a 10 pacientů s RRMS. Po 4 dnech společné kultivace budou CD25+ Treg buňky odstraněny pomocí magnetických kuliček a zbývající CD4+CD25- buňky budou ozářeny a znovu naneseny v poměru 1:10 s autologními CD4+CD25- T buňkami a stimulovány destičkou -imobilizoval aCD3 a aCD28 mAb na dalších 5 dní, aby se prokázal supresivní účinek iTregs. Buněčná proliferace (měřená inkorporací 3[H]) a sekrece TGF-β a IL-10 v SN bude měřena za účelem stanovení supresivní funkce iTreg indukované CD4+CD25+CD127-Tregs v efektorových CD4+ buňkách. Ve druhé kokultuře budou výzkumníci také zkoumat, do jaké míry je indukce iTreg zprostředkována prostřednictvím kontaktu mezi buňkami (blokován propustnou membránou) nebo rozpustnými cytokiny (blokovanými aIL-10, aTGF-B nebo aIL -4 mAb).

Cíl 2.C. Charakterizujte účinek imunoregulačních cytokinů produkovaných iTreg na rekonstituci imunitní tolerance.

Výzkumníci budou měřit hladiny IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 a IL-10, TGF-B a IL-35 v SN výše uvedených kokultur. iTregs a CD4+ buněk odvozených od pacientů s RRMS a HC po 48 hodinách. Vyšetřovatelé budou měřit expresi MHC třídy I a II, CD80, CD86, CD40 a CD58 ve zbývajících vzorcích PBMC získaných ve specifickém cíli 2B u 10 pacientů s HC a 10 pacientů s RRMS v CD19+-govaných B buňkách, CD14+-govaných monocytech, a CD1c-gated DC pomocí průtokové cytometrie, jak je uvedeno v naší předchozí studii 43. Vyšetřovatelé budou zkoumat, do jaké míry počty iTreg a produkce IL-10 a TGF-B iTregs, stejně jako sérové ​​hladiny IL-10 a TGF-B korelují s inhibicí exprese MHC a kostimulačních molekul v B buňkách, monocytech a DC u pacientů s HC a RRMS.