Mangelhafte T-regulatorische Zellfunktion (Treg) bei Patienten mit schubförmig remittierender Multipler Sklerose

In die Studie werden 40 RRMS-Patienten (Alter 18–55, erweiterte Behinderungsstatusskala (EDSS) 0–6) und 40 alters-, geschlechts- und rassenangepasste gesunde Kontrollpersonen (HCs) aufgenommen. Die Studienteilnehmer werden an der MS-Klinik der Thomas Jefferson University eingeschrieben, die als tertiäres Überweisungszentrum dient.

Die Einschlusskriterien sind bestätigte Diagnose von RRMS gemäß den diagnostischen Kriterien von McDonald's12, Alter 18–55 einschließlich, Extended Disability Status Score (EDSS) 1,5–5,5 und keine immunmodulatorische Therapie zum Zeitpunkt der Studie. Der behandlungsfreie Zeitraum beträgt mindestens 4 Wochen für i.v. Methylprednisolon, Interferon-beta, Glatirameracetat, Fingolimod, Tecfidera und Natalizumab. Patienten, die zuvor mit immunsuppressiven Therapien behandelt wurden, einschließlich Azathioprin, Methotrexat, Mitoxantron und Cyclophosphamid, werden nicht in die Studie aufgenommen. Zu den Ausschlusskriterien gehören eine gleichzeitige Infektion, ein signifikanter medizinischer und psychiatrischer Zustand nach Ermessen des Hauptprüfarztes. Schwangere Frauen und Patienten, die an anderen Forschungsstudien teilnehmen, werden nicht in diese Studie aufgenommen. 40 gesunde Kontrollpersonen, die hinsichtlich Alter, Geschlecht und Rasse mit der Gruppe der RR-MS-Patienten übereinstimmen, werden als Kontrollgruppe in die Studie aufgenommen.

Ziel 1. A. Identifizierung der phänotypischen Veränderungen in CD4+CD25+CD127-nTregs bei RRMS-Patienten.

Das Transkriptionsprofil von sortierten CD4+CD25+CD127-Tregs wird unter Verwendung von RNAseq in der ersten Kohorte von 10 HCs und 10 RRMS-Patienten durchgeführt. CD4+CD25+CD127- Treg-Zellen werden aus CD4+-Zellen mit Magnetperlen separiert. cDNA wird mit dem SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing generiert. Der Nachweis unterschiedlich exprimierter Gene zwischen RRMS-Patienten und HC-abgeleiteten Treg-Zellen wird die funktionelle Charakterisierung von Treg-Zellen bei RRMS ermöglichen. Die RNA-Seq-Experimente und die Datenanalyse werden von Dr. Paolo Fortina und Dr. Adam Ertel am TJU Sidney Kimmel Cancer Center durchgeführt. Die differentielle Genexpression in RRMS-Tregs, die durch RNAseq identifiziert wurden, wird durch RT-PCR und Western-Blotting bestätigt.

Durchflusszytometrie-Studien unter Verwendung von Proben peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) aus der zweiten Kohorte von HCs und RRMS-Patienten (10 Spender in jeder Gruppe) werden verwendet, um Veränderungen in der Expression der Treg-Proteinmarker bei RRMS-Patienten zu bestimmen. Individuelle Treg-Marker verleihen spezifische Unterdrückungsmechanismen. Für die umfassende phänotypische Treg-Profilierung bestimmen die Forscher den Prozentsatz von CTLA-4-, CD39-, GZB-, Perforin-, GITR-, OX40-, HLADR-, TNFR2-, Tim-3-, programmierter Todesrezeptor- (PD-1) und LAG3-positiven Zellen darin die CD4+CD25+CD127--gated Tregs. Die FOXP3-, GZB- und Perforin-Expression wird durch intrazelluläre Färbung sowie die TGF-B-, IL-10- und IL-35-Zytokinsekretion der Tregs bestimmt, die zu ihrer unterdrückenden Funktion beitragen können (2x106 PBMCs pro 14-Farben-Färbung).

Ziel 1.B. Charakterisieren Sie das funktionelle Defizit von nTregs bei RRMS. Funktionelle Suppressionsassays werden die Treg-Suppressionsfunktion in einer dritten Kohorte von 10 HC- und 10 RRMS-Patienten vergleichen.

Die Hypothese ist, dass Treg-Kokulturen mit Teff-Zellen aus HCs die Konzentration von TGF-B, IL-10 und IL-35 erhöhen und die Konzentrationen von IFN-γ und IL-17A in Kulturüberständen (SNs) im Vergleich dazu verringern die Suppressionstests unter Verwendung von Treg- und Teff-Zellen von RRMS-Patienten. Um die Anfälligkeit von Teff-Zellen bei RRMS-Patienten im Vergleich zu HCs zu untersuchen, werden die Suppressionsassays in einem Cross-Over-Design-Experiment durchgeführt:

1. RMS-Tregs + RRMS-Teff-Zellen
2. HC Tregs+HC Teff-Zellen
3. RRMS Tregs+HC Teff-Zellen
4. HC Tregs+RRMS Teff-Zellen

Sortierte 2x104 CD4+CD25+CD127- Tregs pro Bedingung werden mit autologen Teff CFSE-gefärbten CD4+CD25-CD127+ Zellen in Gegenwart von aCD3 (0,5 ug/ml) und aCD28 (1 ug/ml) mAb und 105 co-kultiviert bestrahlte antigenpräsentierende Zellen (PBMCs - CD4+-Zellen) in Verhältnissen von 1:1 und 1:10. Die Forscher werden die Proliferation über die CFSE-Verdünnung in den Teff-Zellen und die Zytokinsekretion in den SNs von Zellkulturen messen, um festzustellen, inwieweit Treg-Zellen von RRMS-Patienten im Vergleich zu HCs eine verringerte Unterdrückung aufweisen. Die IFN-y-, IL-17A-, IL-17F-, IL-21-, IL-10-, TGF-B- und IL-4-Zytokinmessungen werden mit ELISA durchgeführt.

Ziel 1.C. Bestimmen Sie die Auswirkungen von IL-7 auf die unterdrückende Funktion der nTregs bei RRMS.

Da unsere vorläufigen Daten IL-7-induzierte STAT5-Phosphorylierung und FOXP3-Expression sowie IL-7-in-vitro-induzierte Treg-Proliferation identifiziert haben, werden die Forscher die Serum-IL-7-Spiegel mit den Treg-Zahlen (% der CD4+-Zellen x Gesamtzahl der Zellen) und ihre unterdrückende Funktion, und untersuchen Sie die Wirkung der Vorinkubation von Tregs mit diesem Zytokin auf ihre unterdrückende Funktion.

Ziel 2.A. Bestimmen Sie den Phänotyp von iTreg-Zellen bei RRMS-Patienten. Durchflusszytometrische Studien der IL-10+CD4+- und TGF-B+CD4+-Zellen, die von RRMS-Patienten und HCs stammen, werden krankheitsspezifische Phänotypen von iTregs identifizieren, die funktionelle Veränderungen von iTregs bei RRMS widerspiegeln können. Die Ermittler werden dieselben Proben aus der Kohorte von RRMS-Patienten und HCs untersuchen, die in das spezifische Ziel 1.A aufgenommen wurden. Durchflusszytometrie-Studien der Gated CD4+IL-10+- und CD4+TGF-B+-Zellen werden unter Verwendung von Oberflächenmarkerfärbung für CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b und LAG-3 und intrazellulärer Färbung für durchgeführt FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, der Repressor von GATA-3 (ROG), der Arylhydrocarbonrezeptor (AhR) und c-Maf-Transkriptionsfaktoren.

Ziel 2.B. Identifizieren Sie die Mechanismen der mangelhaften nTreg-Induktion von iTregs bei RRMS.

Unterdrückungsassays werden wie in Ziel 1.B beschrieben unter Verwendung von CD4+CD25+CD127-Treg- und CD4+CD25-CD127+-Teff-Zellen durchgeführt, die aus der vierten Kohorte von 10 HCs und 10 RRMS-Patienten stammen. Nach 4 Tagen Kokultur werden CD25+ Treg-Zellen mit Magnetperlen entfernt, und die verbleibenden CD4+CD25-Zellen werden bestrahlt und im Verhältnis 1:10 mit autologen CD4+CD25-T-Zellen erneut ausplattiert und durch Platte stimuliert -immobilisierte mAb aCD3 und aCD28 für weitere 5 Tage, um die unterdrückende Wirkung von iTregs zu demonstrieren. Die Zellproliferation (gemessen durch 3[H]-Einbau) und die TGF-β- und IL-10-Sekretion in den SNs werden gemessen, um die iTreg-unterdrückende Funktion zu bestimmen, die durch CD4+CD25+CD127-Tregs in den Effektor-CD4+-Zellen induziert wird. In der zweiten Kokultur werden die Forscher auch untersuchen, inwieweit die iTreg-Induktion über Zell-zu-Zell-Kontakt (blockiert durch eine durchlässige Membran) oder durch lösliche Zytokine (blockiert durch aIL-10, aTGF-B oder aIL) vermittelt wird -4 mAk).

Ziel 2.C. Charakterisieren Sie die Wirkung der iTreg-produzierten immunregulatorischen Zytokine auf die Wiederherstellung der Immuntoleranz.

Die Ermittler messen die IFN-y-, IL-17A-, IL-17F-, IL-21-, IL-22-, IL-9- und IL-10-, TGF-B- und IL-35-Spiegel in den SNs der oben genannten Co-Kulturen von iTregs und CD4+-Zellen, die von RRMS-Patienten und HCs stammen, nach 48 h. Die Prüfärzte messen die Expression der MHC-Klassen I und II, CD80, CD86, CD40 und CD58 in den verbleibenden PBMC-Proben, die im Rahmen des spezifischen Ziels 2B bei 10 HCs und 10 RRMS-Patienten in CD19+-gesteuerten B-Zellen, CD14+-gesteuerten Monozyten, und CD1c-gesteuerte DCs unter Verwendung von Durchflusszytometrie, wie in unserer vorherigen Studie berichtet 43. Die Forscher werden untersuchen, inwieweit die iTreg-Zahlen und die IL-10- und TGF-B-Produktion von iTregs sowie die IL-10- und TGF-B-Serumspiegel mit der Hemmung der Expression von MHC und costimulatorischen Molekülen in B-Zellen, Monozyten und DCs bei HCs- und RRMS-Patienten.