Niedobór funkcji komórki regulatorowej T (Treg) u pacjentów z rzutowo-remisyjną postacią stwardnienia rozsianego

Do badania zostanie włączonych 40 pacjentów z RRMS (w wieku 18-55 lat, rozszerzona skala statusu niepełnosprawności (EDSS) 0-6) oraz 40 dobranych pod względem wieku, płci i rasy zdrowych osób kontrolnych (HC). Badani zostaną zapisani do kliniki SM na Uniwersytecie Thomasa Jeffersona, która służy jako trzeciorzędny ośrodek referencyjny.

Kryteria włączenia to potwierdzone rozpoznanie RRMS zgodnie z kryteriami diagnostycznymi McDonald's12, wiek 18-55 włącznie, rozszerzona ocena stanu niepełnosprawności (EDSS) 1,5-5,5 oraz brak leczenia immunomodulującego w czasie badania. Okres wolny od leczenia będzie wynosił co najmniej 4 tygodnie dla dożylnego metyloprednizolonu, interferonu-beta, octanu glatirameru, fingolimodu, tecfidery i natalizumabu. Pacjenci leczeni wcześniej lekami immunosupresyjnymi, w tym azatiopryną, metotreksatem, mitoksantronem i cyklofosfamidem, nie zostaną włączeni do badania. Kryteria wykluczenia obejmują współistniejącą infekcję, poważny stan medyczny i psychiatryczny według uznania głównego badacza. Kobiety w ciąży i pacjenci biorący udział w innych badaniach naukowych nie zostaną włączeni do tego badania. 40 zdrowych osób kontrolnych dobranych pod względem wieku, płci i rasy z grupą pacjentów z RR SM zostanie włączonych do badania jako grupa kontrolna.

Cel 1. A. Zidentyfikować zmiany fenotypowe w CD4+CD25+CD127-nTregs u pacjentów z RRMS.

Profilowanie transkrypcyjne posortowanych Treg CD4+CD25+CD127- zostanie przeprowadzone przy użyciu RNAseq w pierwszej kohorcie 10 pacjentów z HC i 10 pacjentów z RRMS. Komórki CD4+CD25+CD127-Treg zostaną posortowane z komórek CD4+ rozdzielonych kulkami magnetycznymi. cDNA zostanie wygenerowane przy użyciu zestawu SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing. Wykrywanie różnicowo eksprymowanych genów między pacjentami z RRMS a komórkami Treg pochodzącymi z HC pozwoli na funkcjonalną charakterystykę komórek Treg w RRMS. Eksperymenty z seq RNA i analiza danych zostaną przeprowadzone przez dr Paolo Fortinę i dr Adama Ertela z TJU Sidney Kimmel Cancer Center. Zróżnicowana ekspresja genów w RRMS Treg zidentyfikowana przez RNAseq zostanie potwierdzona przez RT-PCR i western blotting.

Badania cytometrii przepływowej z wykorzystaniem próbek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z drugiej kohorty pacjentów z HC i RRMS (10 dawców w każdej grupie) zostaną wykorzystane do określenia zmian w ekspresji markerów białkowych Treg u pacjentów z RRMS. Poszczególne markery Treg nadają określone mechanizmy supresji. W celu kompleksowego profilowania fenotypowego Treg, badacze określą odsetek CTLA-4, CD39, GZB, perforyny, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, receptora zaprogramowanej śmierci (PD-1) i komórek LAG3-dodatnich w obrębie Treg bramkowane CD4+CD25+CD127. Ekspresja FOXP3, GZB i perforyny zostanie określona za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego, jak również sekrecji cytokin Treg TGF-B, IL-10 i IL-35, co może przyczynić się do ich funkcji supresyjnej (2x106 PBMC na 14 barwienia).

Cel 1.B. Scharakteryzuj funkcjonalny deficyt nTregs w RRMS. Funkcjonalne testy supresji porównają funkcję supresji Treg w trzeciej kohorcie 10 pacjentów z HC i 10 RRMS.

Hipoteza jest taka, że ​​współhodowle Treg z komórkami Teff z HC zwiększą stężenie TGF-B, IL-10 i IL-35 oraz zmniejszą stężenia IFN-γ i IL-17A w supernatantach hodowli (SN) w porównaniu z testy supresji przy użyciu komórek Treg i Teff od pacjentów z RRMS. W celu zbadania wrażliwości komórek Teff u pacjentów z RRMS w porównaniu z HC, testy supresji zostaną przeprowadzone w eksperymentach typu cross-over:

1. Komórki RMS Tregs + RRMS Teff
2. Komórki HC Tregs + HC Teff
3. Komórki RRMS Tregs+HC Teff
4. Komórki HC Tregs+RRMS Teff

Posortowane 2x104 CD4+CD25+CD127- Treg na warunek będą hodowane razem z autologicznymi komórkami CD4+CD25-CD127+ barwionymi Teff CFSE w obecności aCD3 (0,5 ug/ml) i aCD28 (1 ug/ml) mAb i 105 napromieniowane komórki prezentujące antygen (PBMC - komórki CD4+) w stosunkach 1:1 i 1:10. Badacze zmierzą proliferację poprzez rozcieńczenie CFSE w komórkach Teff i wydzielanie cytokin w SN kultur komórkowych, aby określić, w jakim stopniu komórki Treg od pacjentów z RRMS wykazują zmniejszoną supresję w porównaniu z HC. Pomiary cytokin IFN-γ, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B i IL-4 zostaną przeprowadzone przy użyciu testu ELISA.

Cel 1.C. Określ wpływy IL-7 na hamującą funkcję nTreg w RRMS.

Ponieważ nasze wstępne dane zidentyfikowały indukowaną przez IL-7 fosforylację STAT5 i ekspresję FOXP3, jak również proliferację Treg indukowaną in vitro przez IL-7, badacze skorelują poziomy IL-7 w surowicy z liczbami Treg (% komórek CD4 + x całkowitą liczbę komórek) i ich funkcji supresyjnej oraz zbadać wpływ wstępnej inkubacji Treg z tą cytokiną na ich funkcję supresyjną.

Cel 2.A. Określenie fenotypu komórek iTreg u pacjentów z RRMS. Badania cytometrii przepływowej komórek IL-10+CD4+ i TGF-B+CD4+ pochodzących od pacjentów z RRMS i HC pozwolą zidentyfikować specyficzny dla choroby fenotyp iTreg, który może odzwierciedlać zmiany funkcjonalne iTreg w RRMS. Badacze zbadają te same próbki z kohorty pacjentów z RRMS i HC włączonych do celu szczegółowego 1.A. Badania metodą cytometrii przepływowej bramkowanych komórek CD4+IL-10+ i CD4+TGF-B+ zostaną przeprowadzone przy użyciu barwienia markerem powierzchniowym dla CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b i LAG-3 oraz barwienia wewnątrzkomórkowego dla FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, represor GATA-3 (ROG), receptor węglowodorów arylowych (AhR) i czynniki transkrypcyjne c-Maf.

Cel 2.B. Zidentyfikuj mechanizmy niedoboru indukcji nTreg iTreg w RRMS.

Testy supresyjne zostaną przeprowadzone jak opisano w Celu 1.B przy użyciu komórek CD4+CD25+CD127-Treg i CD4+CD25-CD127+ Teff pochodzących z czwartej kohorty 10 pacjentów z HC i 10 RRMS. Po 4 dniach wspólnej hodowli komórki Treg CD25+ zostaną usunięte za pomocą kulek magnetycznych, a pozostałe komórki CD4+CD25- zostaną napromieniowane i ponownie wysiane w stosunku 1:10 z autologicznymi komórkami T CD4+CD25- i stymulowane przez płytkę -immobilizowano mAb aCD3 i aCD28 przez dodatkowe 5 dni w celu wykazania efektu supresyjnego iTregs. Proliferacja komórek (mierzona przez wbudowanie 3[H]) i wydzielanie TGF-β i IL-10 w SN będą mierzone w celu określenia funkcji supresyjnej iTreg indukowanej przez CD4+CD25+CD127-Treg w efektorowych komórkach CD4+. W drugiej kokulturze badacze zbadają również, w jakim stopniu w indukcji iTreg pośredniczy kontakt między komórkami (blokowany przez przepuszczalną błonę) lub rozpuszczalne cytokiny (blokowane przez aIL-10, aTGF-B lub aIL -4 mAb).

Cel 2.C. Scharakteryzuj wpływ cytokin immunoregulacyjnych wytwarzanych przez iTreg na odtwarzanie tolerancji immunologicznej.

Badacze zmierzą poziomy IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 i IL-10, TGF-B i IL-35 w SN powyższych kokultur komórek iTregs i CD4+ pochodzących od pacjentów z RRMS i HC po 48 godzinach. Badacze zmierzą ekspresję MHC klasy I i II, CD80, CD86, CD40 i CD58 w pozostałych próbkach PBMC uzyskanych w Celu Specyficznym 2B u 10 HC i 10 pacjentów z RRMS w limfocytach B bramkowanych CD19+, monocytach bramkowanych CD14+, i DC bramkowane CD1c przy użyciu cytometrii przepływowej, jak podano w naszym poprzednim badaniu 43. Badacze zbadają, w jakim stopniu liczba iTreg oraz produkcja IL-10 i TGF-B przez iTreg, a także poziomy IL-10 i TGF-B w surowicy korelują z hamowaniem ekspresji MHC i cząsteczek kostymulujących w limfocytach B, monocytach i DC u pacjentów z HC i RRMS.