Bristfällig T Regulatory Cell (Treg) funktion hos patienter med återfallande remitterande multipel skleros

Studien kommer att inkludera 40 RRMS-patienter (ålder 18-55, utökad skala för handikappstatus (EDSS) 0-6) och 40 ålders-, köns- och rasmatchade Healthy Controls (HCs). Studieämnena kommer att skrivas in vid Thomas Jefferson University MS-klinik, som fungerar som ett tertiärt remisscenter.

Inklusionskriterierna är bekräftad diagnos av RRMS enligt McDonald's diagnostiska kriterier12, ålder 18-55 inklusive, utökad funktionshinderstatus (EDSS) 1,5-5,5 och ingen immunmodulerande terapi vid tidpunkten för studien. Behandlingsfri period kommer att vara minst 4 veckor för IV Metylprednisolon, Interferon-beta, Glatirameracetat, Fingolimod, Tecfidera och Natalizumab. Patienter som tidigare behandlats med immunsuppressiva terapier, inklusive azatioprin, metotrexat, mitoxantron och cyklofosfamid kommer inte att inkluderas i studien. Uteslutningskriterier kommer att inkludera samtidig infektion, betydande medicinskt och psykiatriskt tillstånd enligt huvudutredarens beslut. Gravida kvinnor och patienter som deltar i andra forskningsstudier kommer inte att inkluderas i denna studie. 40 friska kontroller matchade för ålder, kön och ras med gruppen av RR MS-patienter kommer att inkluderas i studien som en kontrollgrupp.

Syfte 1. A. Identifiera fenotypförändringarna i CD4+CD25+CD127-nTregs hos RRMS-patienter.

Transkriptionell profilering av sorterade CD4+CD25+CD127-Tregs kommer att utföras med RNAseq i den första kohorten av 10 HCs och 10 RRMS-patienter. CD4+CD25+CD127- Treg-celler kommer att sorteras från magnetiska pärlor separerade CD4+-celler. cDNA kommer att genereras med hjälp av SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit för sekvensering. Detekteringen av differentiellt uttryckta gener mellan RRMS-patienter och HC-härledda Treg-celler kommer att tillåta funktionell karakterisering av Treg-celler i RRMS. RNA-seq-experimenten och dataanalysen kommer att utföras av Dr. Paolo Fortina och Dr. Adam Ertel vid TJU Sidney Kimmel Cancer Center. Det differentiella genuttrycket i RRMS Tregs som identifieras av RNAseq kommer att bekräftas via RT-PCR och western blotting.

Flödescytometristudier med användning av prover från perifera blodmononukleära celler (PBMC) från den andra kohorten av HC- och RRMS-patienter (10 donatorer i varje grupp) kommer att användas för att bestämma förändringar i uttrycket av Treg-proteinmarkörerna hos RRMS-patienter. Individuella Treg-markörer ger specifika undertryckningsmekanismer. För den omfattande Treg-fenotypiska profileringen kommer utredarna att bestämma andelen CTLA-4, CD39, GZB, perforin, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, programmerad dödsreceptor (PD-1) och LAG3-positiva celler inom CD4+CD25+CD127--gated Tregs. FOXP3, GZB och perforin uttryck kommer att bestämmas med hjälp av intracellulär färgning, såväl som Tregs TGF-B, IL-10 och IL-35 cytokinutsöndring, vilket kan bidra till deras undertryckande funktion (2x106 PBMCs per 14 färgning).

Mål 1.B. Karakterisera det funktionella underskottet av nTregs i RRMS. Funktionella suppressionsanalyser kommer att jämföra Treg-undertryckande funktion i en tredje kohort av 10 HC- och 10 RRMS-patienter.

Hypotesen är att Treg-samkulturer med Teff-celler från HC:er kommer att öka koncentrationen av TGF-B, IL-10 och IL-35 och minska koncentrationerna av IFN-y och IL-17A i odlingssupernatanter (SN) i jämförelse med suppressionsanalyserna med hjälp av Treg- och Teff-celler från RRMS-patienter. För att undersöka känsligheten hos Teff-celler hos RRMS-patienter i jämförelse med HC, kommer suppressionsanalyserna att utföras i ett cross-over-designexperiment:

1. RMS Tregs+RRMS Teff-celler
2. HC Tregs+HC Teff-celler
3. RRMS Tregs+HC Teff-celler
4. HC Tregs+RRMS Teff-celler

Sorterade 2x104 CD4+CD25+CD127- Tregs per tillstånd kommer att samodlas med autologa Teff CFSE-färgade CD4+CD25-CD127+ celler i närvaro av aCD3 (0,5 ug/ml) och aCD28 (1 ug/ml) mAb och 105 bestrålade antigenpresenterande celler (PBMCs - CD4+-celler) vid förhållanden 1:1 och 1:10. Utredarna kommer att mäta proliferation via CFSE-spädning i Teff-cellerna och cytokinutsöndring i cellkulturernas SN:er för att bestämma i vilken utsträckning Treg-celler från RRMS-patienter uppvisar minskad suppression jämfört med HC:er. IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B och IL-4 cytokinmätningar kommer att utföras med användning av ELISA.

Syfte 1.C. Bestäm effekterna av IL-7 på nTregs suppressiva funktion i RRMS.

Eftersom våra preliminära data har identifierat IL-7-inducerad STAT5-fosforylering och FOXP3-uttryck, såväl som IL-7 in vitro-inducerad Treg-proliferation, kommer utredarna att korrelera serum-IL-7-nivåerna med Treg-talen (% av CD4+-celler x totalt antal celler) och deras undertryckande funktion, och undersök effekten av förinkubation av Tregs med denna cytokin till deras undertryckande funktion.

Mål 2.A. Bestäm fenotypen av iTreg-celler hos RRMS-patienter. Flödescytometristudier av IL-10+CD4+- och TGF-B+CD4+-celler härledda från RRMS-patienter och HC:er kommer att identifiera sjukdomsspecifik fenotyp av iTregs, vilket kan återspegla funktionella förändringar av iTregs i RRMS. Utredarna kommer att undersöka samma prover från en kohort av RRMS-patienter och HC:er som är inskrivna i specifikt mål 1.A. Flödescytometristudier av de gated CD4+IL-10+ och CD4+TGF-B+ cellerna kommer att utföras med användning av ytmarkörfärgning för CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b och LAG-3 och intracellulär färgning för FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, repressorn för GATA-3 (ROG), arylkolvätereceptorn (AhR) och c-Maf-transkriptionsfaktorer.

Mål 2.B. Identifiera mekanismerna för bristfällig nTreg-induktion av iTregs i RRMS.

Undertryckande analyser kommer att utföras enligt beskrivningen i mål 1.B med användning av CD4+CD25+CD127-Treg och CD4+CD25-CD127+ Teff-celler härledda från den fjärde kohorten av 10 HCs och 10 RRMS-patienter. Efter 4 dagars samodling kommer CD25+ Treg-celler att avlägsnas med hjälp av magnetiska pärlor, och de återstående CD4+CD25-cellerna kommer att bestrålas och återutströks i ett förhållande 1:10 med autologa CD4+CD25-T-celler och stimuleras av plattan -immobiliserade aCD3 och aCD28 mAb i ytterligare 5 dagar för att demonstrera den undertryckande effekten av iTregs. Cellproliferation (mätt genom 3[H]-inkorporering) och TGF-β och IL-10-utsöndring i SN:erna kommer att mätas för att bestämma den iTreg-undertryckande funktionen inducerad av CD4+CD25+CD127-Tregs i effektorns CD4+-celler. I den andra samkulturen kommer utredarna också att undersöka i vilken utsträckning iTreg-induktionen förmedlas via cell-till-cell-kontakt (blockerad av ett permeabelt membran) eller av lösliga cytokiner (blockerade av aIL-10, aTGF-B eller aIL) -4 mAb).

Syfte 2.C. Karakterisera effekten av de iTreg-producerade immunregulatoriska cytokinerna på rekonstitutionen av immuntolerans.

Utredarna kommer att mäta nivåerna av IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 och IL-10, TGF-B och IL-35 i SN:erna för ovanstående samkulturer av iTregs och CD4+-celler härledda från RRMS-patienter och HC:er vid 48 timmar. Utredarna kommer att mäta uttrycket av MHC klass I och II, CD80, CD86, CD40 och CD58 i de återstående PBMC-proverna som erhållits i Specific Aim 2B i 10 HC:er och 10 RRMS-patienter i CD19+-gated B-celler, CD14+-gated monocyter, och CD1c-gated DCs med flödescytometri, som rapporterats i vår tidigare studie 43. Utredarna kommer att undersöka i vilken utsträckning iTreg-tal och iTregs IL-10- och TGF-B-produktion, samt IL-10- och TGF-B-serumnivåer korrelerar med hämningen av MHC och samstimulerande molekylers uttryck i B-celler, monocyter och DCs i HCs och RRMS-patienter.