Puutteellinen T-säätelysolujen (Treg) toiminta potilailla, joilla on uusiutuva, etenevä multippeliskleroosi

Tutkimukseen otetaan mukaan 40 RRMS-potilasta (ikä 18–55, laajennettu vammaisuusasteikko (EDSS) 0–6) ja 40 iän, sukupuolen ja rodun mukaan sovitettua terveellistä kontrollia (HC). Tutkimuskohteet ilmoittautuvat Thomas Jeffersonin yliopiston MS-klinikalle, joka toimii kolmannen asteen lähetekeskuksena.

Sisällyttämiskriteerit ovat McDonald'sin diagnostisten kriteerien12 mukainen vahvistettu RRMS-diagnoosi, ikä 18-55 mukaan lukien, laajennettu vammaisuuspistemäärä (EDSS) 1,5-5,5 ja ei immunomoduloivaa hoitoa tutkimuksen aikana. Hoitovapaa ajanjakso on vähintään 4 viikkoa IV Metyyliprednisolonin, Interferoni-beetan, Glatirameeriasetaatin, Fingolimodin, Tecfideran ja Natalitsumabin kohdalla. Potilaita, joita on aiemmin hoidettu immunosuppressiivisilla hoidoilla, mukaan lukien atsatiopriini, metotreksaatti, mitoksantroni ja syklofosfamidi, ei oteta mukaan tutkimukseen. Poissulkemiskriteereitä ovat muun muassa samanaikainen infektio, merkittävä lääketieteellinen ja psykiatrinen tila päätutkijan harkinnan mukaan. Raskaana olevia naisia ​​ja muihin tutkimustutkimuksiin osallistuvia potilaita ei oteta mukaan tähän tutkimukseen. 40 tervettä kontrollia, jotka vastaavat iän, sukupuolen ja rodun perusteella RR-MS-potilaiden ryhmää, otetaan mukaan tutkimukseen kontrolliryhmänä.

Tavoite 1. A. Tunnista fenotyyppimuutokset CD4+CD25+CD127-nTreg:issä RRMS-potilailla.

Lajiteltujen CD4+CD25+CD127- Tregien transkriptioprofilointi suoritetaan RNAseq:n avulla ensimmäisessä kohortissa, jossa on 10 HC:tä ja 10 RRMS-potilasta. CD4+CD25+CD127- Treg-solut lajitellaan magneettihelmillä erotetuista CD4+-soluista. cDNA luodaan käyttämällä SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit -sarjaa sekvensointiin. Erilaisesti ilmentyneiden geenien havaitseminen RRMS-potilaiden ja HC-peräisten Treg-solujen välillä mahdollistaa Treg-solujen toiminnallisen karakterisoinnin RRMS:ssä. RNA-seq-kokeet ja data-analyysin suorittavat tohtori Paolo Fortina ja tohtori Adam Ertel TJU Sidney Kimmel Cancer Centerissä. RNAseq:n tunnistamien RRMS-tregien differentiaalinen geeniekspressio varmistetaan RT-PCR:llä ja Western blot -menetelmällä.

Virtaussytometriatutkimuksia, joissa käytetään perifeerisen veren mononukleaarisolunäytteitä (PBMC) toisesta HC- ja RRMS-potilaiden kohortista (10 luovuttajaa kussakin ryhmässä), käytetään määrittämään muutoksia Treg-proteiinimarkkerien ilmentymisessä RRMS-potilailla. Yksittäiset Treg-markkerit tarjoavat erityisiä tukahduttamismekanismeja. Kattavaa Treg-fenotyyppiprofiilia varten tutkijat määrittävät CTLA-4-, CD39-, GZB-, perforiini-, GITR-, OX40-, HLADR-, TNFR2-, Tim-3-, ohjelmoidun kuolemanreseptorin (PD-1) ja LAG3-positiivisten solujen prosenttiosuuden. CD4+CD25+CD127-portit Tregit. FOXP3:n, GZB:n ja perforiinin ilmentyminen määritetään käyttämällä solunsisäistä värjäystä sekä Tregin TGF-B:n, IL-10:n ja IL-35:n sytokiinieritystä, mikä saattaa edistää niiden suppressoivaa toimintaa (2 x 106 PBMC:tä 14 värivärjäystä kohti).

Tavoite 1.B. Kuvaile nTregien toiminnallista puutetta RRMS:ssä. Funktionaalisissa suppressiomäärityksissä verrataan Treg-suppressiivista toimintaa kolmannessa kohortissa, jossa on 10 HC- ja 10 RRMS-potilasta.

Oletuksena on, että Treg-yhteisviljelmät HC:n Teff-solujen kanssa lisäävät TGF-B:n, IL-10:n ja IL-35:n pitoisuutta ja vähentävät IFN-y:n ja IL-17A:n pitoisuuksia viljelmän supernatanteissa (SN:t) verrattuna suppressiomääritykset käyttäen Treg- ja Teff-soluja RRMS-potilailta. Jotta voidaan tutkia Teff-solujen herkkyyttä RRMS-potilailla verrattuna HC:ihin, suppressiomääritykset suoritetaan cross-over-suunnittelukokeissa:

1. RMS Tregs+RRMS Teff -solut
2. HC Tregs+HC Teff -solut
3. RRMS Tregs+HC Teff -solut
4. HC Tregs+RRMS Teff-solut

Lajiteltu 2x104 CD4+CD25+CD127- Tregiä per ehto viljellään yhdessä autologisten Teff CFSE:llä värjättyjen CD4+CD25-CD127+ solujen kanssa aCD3:n (0,5 ug/ml) ja aCD28:n (1 ug/ml) mAb:n ja 105:n läsnä ollessa. säteilytetyt antigeenia esittelevät solut (PBMC:t - CD4+-solut) suhteissa 1:1 ja 1:10. Tutkijat mittaavat lisääntymistä CFSE-laimennuksella Teff-soluissa ja sytokiinien erittymistä soluviljelmien SN:issä määrittääkseen, missä määrin RRMS-potilaiden Treg-solut osoittavat vähentynyttä suppressiota verrattuna HC-soluihin. IFN-y-, IL-17A-, IL-17F-, IL-21-, IL-10-, TGF-B- ja IL-4-sytokiinimittaukset suoritetaan käyttämällä ELISA:ta.

Tavoite 1.C. Määritä IL-7:n vaikutukset nTreg-solujen suppressiiviseen toimintaan RRMS:ssä.

Koska alustavat tietomme ovat tunnistaneet IL-7:n aiheuttaman STAT5-fosforylaation ja FOXP3:n ilmentymisen sekä IL-7:n in vitro -indusoidun Treg-proliferaation, tutkijat korreloivat seerumin IL-7-tasot Treg-lukujen kanssa (% CD4+-soluista x solujen kokonaismäärä) ja niiden suppressiivinen toiminta, ja tutkia Tregien esi-inkuboinnin vaikutusta tämän sytokiinin kanssa niiden suppressoivaan toimintaan.

Tavoite 2.A. Määritä iTreg-solujen fenotyyppi RRMS-potilailla. RRMS-potilaista ja HC:istä peräisin olevien IL-10+CD4+- ja TGF-B+CD4+-solujen virtaussytometriset tutkimukset tunnistavat iTreg-solujen sairauskohtaisen fenotyypin, joka saattaa heijastaa iTreg-solujen toiminnallisia muutoksia RRMS:ssä. Tutkijat tutkivat samat näytteet RRMS-potilaiden ja HC-potilaiden kohortista, jotka on rekisteröity erityistavoitteeseen 1.A. Avainnettujen CD4+IL-10+- ja CD4+TGF-B+-solujen virtaussytometriset tutkimukset suoritetaan käyttämällä pintamarkkerivärjäystä CD39-, CTLA-4-, PD-1-, ICOS-, CD46-, CD49b- ja LAG-3-soluille sekä solunsisäistä värjäystä soluille. FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, GATA-3:n (ROG) repressori, aryylihiilivetyreseptori (AhR) ja c-Maf-transkriptiotekijät.

Tavoite 2.B. Tunnista iTreg:ien puutteellisen nTreg-induktion mekanismit RRMS:ssä.

Suppressiiviset määritykset suoritetaan tavoitteessa 1.B kuvatulla tavalla käyttämällä CD4+CD25+CD127-Treg- ja CD4+CD25-CD127+ Teff-soluja, jotka on peräisin 10 HC:n ja 10 RRMS-potilaan neljännestä kohortista. Neljän päivän yhteisviljelyn jälkeen CD25+ Treg -solut poistetaan käyttämällä magneettihelmiä, ja loput CD4+CD25- solut säteilytetään ja maljataan uudelleen suhteessa 1:10 autologisilla CD4+CD25- T-soluilla ja stimuloidaan levyllä. - immobilisoi aCD3:n ja aCD28:n mAb:tä vielä 5 päivän ajan osoittaakseen iTregien estävän vaikutuksen. Solujen lisääntyminen (mitattu 3[H]-inkorporaatiolla) ja TGF-β:n ja IL-10:n eritys SN:issä mitataan CD4+CD25+CD127-Tregien indusoiman iTreg-suppressiivisen toiminnan määrittämiseksi efektori-CD4+-soluissa. Toisessa yhteisviljelmässä tutkijat tutkivat myös, missä määrin iTreg-induktio välittyy solujen välisen kosketuksen kautta (läpäisevän kalvon estämä) tai liukoisten sytokiinien (aIL-10, aTGF-B tai aIL esto) kautta. -4 mAb).

Tavoite 2.C. Kuvaile iTregin tuottamien immunosäätelysytokiinien vaikutusta immuunitoleranssin palautumiseen.

Tutkijat mittaavat IFN-y:n, IL-17A:n, IL-17F:n, IL-21:n, IL-22:n, IL-9:n ja IL-10:n, TGF-B:n ja IL-35:n tasot edellä mainittujen yhteisviljelmien SN:issä iTreg- ja CD4+-soluista, jotka ovat peräisin RRMS-potilaista ja HC:istä 48 tunnin kohdalla. Tutkijat mittaavat MHC-luokan I ja II, CD80:n, CD86:n, CD40:n ja CD58:n ilmentymisen jäljellä olevissa PBMC-näytteissä, jotka on saatu Spesifisessä tavoitteessa 2B, 10 HC:ssä ja 10 RRMS-potilaassa CD19+-porteilla B-soluissa, CD14+-porteilla olevissa monosyyteissä, ja CD1c-porteilla ohjatut DC:t virtaussytometriaa käyttäen, kuten raportoimme edellisessä tutkimuksessamme 43. Tutkijat tutkivat, missä määrin iTreg-luvut ja iTreg-solujen IL-10- ja TGF-B-tuotanto sekä IL-10- ja TGF-B-seerumitasot korreloivat MHC:n ja kostimuloivien molekyylien ilmentymisen eston kanssa B-soluissa, monosyyteissä ja DC:t HC- ja RRMS-potilailla.