Deficiënte T-regulerende celfunctie (Treg) bij patiënten met relapsing-remitting multiple sclerose

De studie zal 40 RRMS-patiënten (leeftijd 18-55, uitgebreide invaliditeitsstatusschaal (EDSS) 0-6) en 40 op leeftijd, geslacht en ras afgestemde gezonde controles (HC's) inschrijven. De proefpersonen zullen worden ingeschreven in de MS-kliniek van de Thomas Jefferson University, die dienst doet als tertiair verwijzingscentrum.

De inclusiecriteria zijn een bevestigde diagnose van RRMS volgens de diagnostische criteria van McDonald's12, leeftijd 18-55 inclusief, uitgebreide invaliditeitsstatusscore (EDSS) 1,5-5,5, en geen immunomodulerende therapie op het moment van het onderzoek. Behandelingsvrije periode zal ten minste 4 weken zijn voor IV Methylprednisolon, Interferon-beta, Glatirameer-acetaat, Fingolimod, Tecfidera en Natalizumab. Patiënten die eerder zijn behandeld met immunosuppressieve therapieën, waaronder azathioprine, methotrexaat, mitoxantron en cyclofosfamide, zullen niet aan het onderzoek deelnemen. Uitsluitingscriteria omvatten gelijktijdige infectie, significante medische en psychiatrische aandoening naar goeddunken van de hoofdonderzoeker. Zwangere vrouwen en patiënten die deelnemen aan andere onderzoeken zullen niet deelnemen aan deze studie. 40 gezonde controles die qua leeftijd, geslacht en ras overeenkomen met de groep RR MS-patiënten zullen als controlegroep in het onderzoek worden opgenomen.

Doel 1. A. Identificeer de fenotypeveranderingen in CD4+CD25+CD127-nTregs bij RRMS-patiënten.

Transcriptionele profilering van gesorteerde CD4+CD25+CD127-Tregs zal worden uitgevoerd met behulp van RNAseq in het eerste cohort van 10 HC's en 10 RRMS-patiënten. CD4+CD25+CD127-Treg-cellen zullen worden gesorteerd uit door magnetische korrels gescheiden CD4+-cellen. cDNA wordt gegenereerd met behulp van de SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing. De detectie van differentieel tot expressie gebrachte genen tussen RRMS-patiënten en HC-afgeleide Treg-cellen zal de functionele karakterisering van Treg-cellen in RRMS mogelijk maken. De RNA seq-experimenten en data-analyse zullen worden uitgevoerd door Dr. Paolo Fortina en Dr. Adam Ertel in het TJU Sidney Kimmel Cancer Center. De differentiële genexpressie in RRMS Tregs geïdentificeerd door RNAseq zal worden bevestigd via RT-PCR en western blotting.

Flowcytometrie-onderzoeken met behulp van monsters van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) van het tweede cohort van HC's en RRMS-patiënten (10 donoren in elke groep) zullen worden gebruikt om veranderingen in de expressie van de Treg-eiwitmarkers bij RRMS-patiënten te bepalen. Individuele Treg-markers verlenen specifieke onderdrukkingsmechanismen. Voor de uitgebreide Treg fenotypische profilering zullen de onderzoekers het percentage CTLA-4, CD39, GZB, perforine, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, geprogrammeerde doodsreceptor (PD-1) en LAG3-positieve cellen binnen de CD4+CD25+CD127-gated Tregs. FOXP3-, GZB- en perforine-expressie zullen worden bepaald met behulp van intracellulaire kleuring, evenals Tregs' TGF-B-, IL-10- en IL-35-cytokinesecretie, die kan bijdragen aan hun onderdrukkende functie (2x106 PBMC's per 14 kleurenkleuring).

Doel 1.B. Karakteriseer het functionele tekort van nTregs in RRMS. Functionele onderdrukkingstesten zullen de Treg-onderdrukkende functie vergelijken in een derde cohort van 10 HC- en 10 RRMS-patiënten.

De hypothese is dat Treg-co-culturen met Teff-cellen van HC's de concentratie van TGF-B, IL-10 en IL-35 zullen verhogen en de concentraties van IFN-y en IL-17A in kweeksupernatanten (SN's) zullen verlagen in vergelijking met de onderdrukkingstesten met behulp van Treg- en Teff-cellen van RRMS-patiënten. Om de gevoeligheid van Teff-cellen bij RRMS-patiënten in vergelijking met HC's te onderzoeken, zullen de suppressietesten worden uitgevoerd in een cross-over ontwerpexperimenten:

1. RMS Tregs + RRMS Teff-cellen
2. HC Tregs + HC Teff-cellen
3. RRMS Tregs + HC Teff-cellen
4. HC Tregs + RRMS Teff-cellen

Gesorteerde 2x104 CD4+CD25+CD127-Tregs per aandoening zullen samen worden gekweekt met autologe Teff CFSE-gekleurde CD4+CD25-CD127+ cellen in aanwezigheid van aCD3 (0,5 ug/ml) en aCD28 (1 ug/ml) mAb en 105 bestraalde antigeenpresenterende cellen (PBMC's - CD4+-cellen) in verhoudingen van 1:1 en 1:10. De onderzoekers zullen proliferatie via CFSE-verdunning in de Teff-cellen en cytokinesecretie in de SN's van celculturen meten om te bepalen in welke mate Treg-cellen van RRMS-patiënten verminderde onderdrukking vertonen in vergelijking met HC's. De IFN-y-, IL-17A-, IL-17F-, IL-21-, IL-10-, TGF-B- en IL-4-cytokinemetingen zullen worden uitgevoerd met behulp van ELISA.

Doel 1.C. Bepaal de effecten van IL-7 op de onderdrukkende functie van nTregs in RRMS.

Aangezien onze voorlopige gegevens IL-7-geïnduceerde STAT5-fosforylering en FOXP3-expressie hebben geïdentificeerd, evenals IL-7 in-vitro-geïnduceerde Treg-proliferatie, zullen de onderzoekers de serum-IL-7-niveaus correleren met de Treg-aantallen (% CD4+-cellen x totaal aantal cellen) en hun onderdrukkende functie, en onderzoek het effect van pre-incubatie van Tregs met dit cytokine op hun onderdrukkende functie.

Doel 2.A. Bepaal het fenotype van iTreg-cellen bij RRMS-patiënten. Flowcytometrie-onderzoeken van de IL-10+CD4+- en TGF-B+CD4+-cellen afgeleid van RRMS-patiënten en HC's zullen het ziektespecifieke fenotype van iTregs identificeren, wat mogelijk een weerspiegeling is van functionele veranderingen van iTregs in RRMS. Onderzoekers zullen dezelfde monsters onderzoeken van een cohort van RRMS-patiënten en HC's die zijn ingeschreven voor specifiek doel 1.A. Flowcytometriestudies van de gated CD4+IL-10+- en CD4+TGF-B+-cellen zullen worden uitgevoerd met behulp van oppervlaktemarkerkleuring voor CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b en LAG-3 en intracellulaire kleuring voor FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, de repressor van GATA-3 (ROG), de arylkoolwaterstofreceptor (AhR) en c-Maf-transcriptiefactoren.

Doel 2.B. Identificeer de mechanismen van gebrekkige nTreg-inductie van iTregs in RRMS.

Suppressieve assay's zullen worden uitgevoerd zoals beschreven in doel 1.B met behulp van CD4+CD25+CD127-Treg- en CD4+CD25-CD127+ Teff-cellen afkomstig van het vierde cohort van 10 HC's en 10 RRMS-patiënten. Na 4 dagen co-cultuur zullen CD25+ Treg-cellen worden verwijderd met behulp van magnetische korrels, en de resterende CD4+CD25-cellen zullen worden bestraald en opnieuw uitgeplaat in een verhouding van 1:10 met autologe CD4+CD25-T-cellen, en gestimuleerd door plaat -immobiliseerde een CD3 en aCD28 mAb gedurende nog eens 5 dagen om het onderdrukkende effect van iTregs aan te tonen. Celproliferatie (gemeten door 3[H]-opname) en TGF-β- en IL-10-secretie in de SN's zullen worden gemeten om de iTreg-onderdrukkende functie te bepalen die wordt geïnduceerd door CD4+CD25+CD127-Tregs in de effector CD4+-cellen. In de tweede co-cultuur zullen de onderzoekers ook onderzoeken in welke mate de iTreg-inductie gemedieerd wordt via cel-op-cel contact (geblokkeerd door een permeabel membraan) of door oplosbare cytokines (geblokkeerd door aIL-10, aTGF-B of aIL -4 mAb).

Doel 2.C. Karakteriseer het effect van de door iTreg geproduceerde immunoregulerende cytokines op de reconstitutie van immuuntolerantie.

Onderzoekers zullen de IFN-y-, IL-17A-, IL-17F-, IL-21-, IL-22-, IL-9- en IL-10-, TGF-B- en IL-35-niveaus meten in de SN's van de bovenstaande co-culturen van iTregs en CD4+-cellen afgeleid van RRMS-patiënten en HC's na 48 uur. De onderzoekers zullen de expressie meten van de MHC klasse I en II, CD80, CD86, CD40 en CD58 in de resterende PBMC-monsters verkregen in Specific Aim 2B bij 10 HC's en 10 RRMS-patiënten in CD19+-gated B-cellen, CD14+-gated monocyten, en CD1c-gated DC's met behulp van flowcytometrie, zoals gerapporteerd in onze vorige studie 43. De onderzoekers zullen onderzoeken in welke mate iTreg-nummers en iTregs' IL-10- en TGF-B-productie, evenals IL-10- en TGF-B-serumspiegels correleren met de remming van MHC en de expressie van co-stimulerende moleculen in B-cellen, monocyten en DC's bij HC's en RRMS-patiënten.