AVFの成熟不全を予測するための炎症マーカーと既存の静脈線維症

動静脈瘻 (AVF) は血液透析に適した血管アクセスであり、外科的に作成されますが、表在静脈を近くの動脈に接続し、動脈循環下でこの静脈の内径を拡大および増加させます。 瘻孔の成熟の成功は、動脈と静脈の拡張とリモデリングに依存しますが、末期腎疾患 (ESRD) 患者の硬くて肥厚した血管は、これらの適応を促進する信号にうまく反応しない場合があります。 AVF の成熟の約 20 ～ 40% が失敗し、AVF の成熟の失敗を防ぐ効果的な治療法はありません。 Paulson WD は、成熟の失敗について 4 つのポイントをまとめました。 外科的技術;既存の血管疾患;アップストリーム イベント。ダウンストリーム イベント。 上流のイベントは、最初に内皮への損傷を引き起こすメカニズムです (外科的外傷、血行力学的せん断応力、針の穿刺による血管壁の損傷など)。 下流のイベントは、内皮損傷に対する応答です (白血球の接着、メディアから内膜層への平滑筋細胞の移動、平滑筋の増殖など)。 ただし、上流および下流のイベントは成熟障害の重要なステップであり、既存の血管疾患は次の段階を設定するため無視されるべきではありません。 内側コラーゲン線維は層状単位に組織化され、健康な血管のクリンプで円周方向に配向します。 ただし、内側のコラーゲン含有量が高いほど、硬くなり、拡張する能力が制限される可能性があります。 最近の研究では、静脈の既存の線維症状態が成熟に関連していることが示されています。

AVF 設定の炎症は、局所炎症と全身炎症の 2 つの部分に分けることができます。 局所炎症については、瘻形成の外傷および局所低酸素症によって引き起こされることが示されていました。 CKD患者に存在する尿毒症のために発生する全身性炎症。 最近の研究では、AVF の失敗が炎症に関連していることが示唆されています。 動脈の血管周囲脂肪は、AVF 成熟の成功を予測できます。 橈側皮静脈の脂肪切除は、血液透析動静脈瘻形成中の常套手段である[9]。 ただし、これまでの研究では、AVF手術中の血管周囲の脂肪と頭静脈の脂肪または除去の間でAVFの成熟を比較したものはほとんどありません。

具体的な目的

瘻孔の成熟の成功は、動脈と静脈の拡張とリモデリングに依存しますが、ESRD 患者の硬くて肥厚した血管は、これらの適応を促進する信号にうまく反応しない場合があります。 私たちの予備データは、既存の血管線維症がAVFの失敗で増加したことを示しましたが。 しかし、発見にはまださらなる検証が必要です。 この研究では、研究者は AVF の成熟または失敗に関連する分子マークの発見に焦点を当てます。 この調査には、次のセクションが含まれます。

1. AVF患者に血管線維症が存在するかどうか、および成熟不全との関連。
2. 血管線維症が炎症と関連しているかどうか。
3. 血液中の好中球のサイトカイン発現を調べます。
4. 橈側皮静脈の血管周囲脂肪がAVF障害に関連しているかどうか

目的 1. AVF 患者に血管線維症が存在するかどうか、および成熟障害との関連性。 研究者は、組織病理学およびウエスタンブロットによって血管線維症を観察します。

まず、被験者は、AVF作成を受ける成人の尿毒症患者です。 この調査では、維持血液透析（HD）を必要とする慢性腎臓病（CKD）のステージ 5（CKD-5）およびステージ 6（CKD-6）の患者を登録します。 調査官は、術前の超音波評価ツールを使用して、ネイティブ AVF を作成するためのアーム血管の実現可能性を確認します。

AVF手術中の血管周囲脂肪の保存または除去の前向きランダム化比較試験として、研究助手が無作為化を支援し、インフォームドコンセントを患者に説明します。 被験者は無作為に 2 つのグループに分けられます。実験グループでは、標的の頭静脈の血管周囲脂肪が保存されます。対照グループでは、AVF 吻合の前に脂肪が除去されます。

外科医は、AVF の作成中に遠位静脈断端と 1 cm の皮下脂肪を少なくとも 1.5​​ cm の長さで採取し、同時に 10 cc の血漿サンプルを取得します。 この調査では、100 人の成人患者を登録し、手術後 3 ～ 12 までに各 AVF 成熟度、JAS、または FTM (以下の定義を参照) に従ってグループに分類します。

術前血管超音波評価。

すべての患者は、手術の適合性を評価するために臨床および超音波検査を受けます。血管および/または臨床状態が血液透析に適していない場合、患者は除外されます。 以下の 3 つの客観的超音波測定に基づく血液透析動静脈瘻 (HDAVF) 成熟度スコア。 0 から 9 点の範囲の要約スコアを指定します。 スコアが高いほど成熟していることを示します。 超音波検査パラメータは次のように定義されています。

1. 腕の動脈径と総血流量を測定します。 上腕動脈は、肘の曲線内の近位 4 (+/- 2.2 ～ 6) cm から測定したものとして定義されます。治験責任医師は、血管の直径を測定し、前腕の総血流量を推定します。
2. 前腕の橈骨動脈スキャンは、肘前部の始点から手首線までスキャンした橈骨動脈の直径として定義されます。 注意すべきこととして、治験責任医師はまた、その直径が 2.0 mm 以上であることを確認し、肘前部からリストラインまでの明らかな狭窄を特定していません。 注目すべきことに、捜査官はまた、その直径> = 2.0 mmを確認し、明らかな狭窄を特定しません.
3. 橈側皮静脈の拡張されていない直径を測定します。 その中間点は、肘のラインと手首のラインの中間として定義され、肘から約 10 (+/- 2、8 ~ 12) cm 遠位にあります。
4. 橈側皮静脈の増大した直径を測定します。 止血帯カフで上腕に一時的に 100 mm-Hg の圧力を加え、中程度の抵抗を提供し、30 秒待ってから、研究者は上記で定義した橈側皮静脈を測定します。 したがって、静脈コンプライアンスの定義は、増強前後の橈側皮静脈の静脈拡張の程度として定義されます。 さらに、静脈のコンプライアンスは、静脈の増強/非増強断面積のパーセンテージとして定義されます。
5. 治験責任医師は、橈側皮静脈の全セグメントの直径が 2.0 mm を超えていることを確認し、重大な狭窄がないことを確認します。

臨床的成功の定義: 目標の HDAVF を 2 本の針で使用し、1 か月に少なくとも 2/3 の処方セッションで HD セッションを完了することができると定義されます。 実行の最小基準は、1.2.14 の目標 sp-Kt/V を達成するための 3.5 時間の HD セッションで 300 ml/分の平均血流速度です。 成功した HD セッションは、透析流量が 200 ml/分を超え、セッション期間が 4 時間以上の HD の完了として定義されます。

超音波パラメーターによる成功の定義: この調査では、客観的な超音波スコアリング システムを提案し、合計スコア 4 以上を AVF 成熟と見なします。

組織学的分析のために、サンプルをパラフィン包埋し、切片にした。 H & E (ヘマトキシリンとエオシン) は、組織学で使用される一般的な染色です。 ヘマトキシリンは細胞核を青色に染色し、エオシンは細胞外マトリックスを染色し、細胞質はピンク色を呈します。 Movat ペンタクローム染色は、組織切片中のコラーゲン、エラスチン、筋肉ムチン、フィブリンを示すことができます。 調査員は、シリウスレッド染色を使用して、組織切片のコラーゲン I および III 繊維を観察します。 カルシウム沈着を検出するために、研究者はアリザンレッド染色を使用します。 染色にはマッソントリクロームを使用します。 トリクローム染色では、平滑筋は赤く、コラーゲンは青く見えます。

ウエスタンブロットアッセイでは、コラーゲン、α-SMA、TIMP-1、および TIMP2 の発現が血管線維症で増加します。 したがって、研究者は、AVFの成熟および不全組織におけるコラーゲン、α-SMA、MMP-9、MMP2、TIMP-1、TIMP2の発現を検出します。 組織を均質化し、溶解した。 各組織抽出物のタンパク質濃度は、供給業者 (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) の指示に従って BCA タンパク質アッセイを使用して決定されました。 レーンあたり50マイクログラムの組織溶解物タンパク質を、還元条件下でSDS-PAGEによって分離し、PVDFメンブレン（Millipore Corp.、Bedford、Massachusetts、USA）にブロットしました。 膜を 5% 脱脂粉乳/PBS/0.1% Tween-20 (PBST) でブロックし、一次抗体と 1 時間インキュベートしました。 ブロットをＰＢＳＴで４回洗浄し、二次ペルオキシダーゼ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）をさらに１時間添加した（１：１０，０００）。 最後に、メンブレンを PBST で洗浄し、メーカーの推奨に従って強化化学発光検出法を使用して抗原の検出を行いました。

目的 2. 血管線維症が炎症と関連しているかどうか。 AVF の状況における炎症は、局所的および全身的に関与していた。 瘻形成の外傷および局所低酸素症によって引き起こされる局所炎症。 そのため、研究者は IL8、IL1b、IL6、IL10、TNF、IL12p70、CCL5(RANTES)、CXCL9 (MIG)、CCL2 (MCP1)、IP10 を測定し、QPCR およびマルチプレックス ELISA によって AVF 成熟組織と不全組織の発現を比較します。 その上、全身性炎症は、慢性腎臓病に存在する尿毒症のために発生します. また、研究者は、IL8、IL1b、IL6、IL10、TNF、IL12p70、CCL5(RANTES)、CXCL9 (MIG)、CCL2 (MCP1)、IP10 の発現を検出し、CBA アッセイによって AVF 成熟と失敗血清の発現を比較します。

QPCRアッセイでは、TRIzolプロトコル（Life Technologies、Invitrogen）によって静脈組織からRNAを抽出しました。 RNA濃度は、Nanodropによって定量化されました。 抽出された全 RNA の純度は 260/280 nm 比として決定され、完全性がチェックされました。 QPCR は、TaqMan システムによって実行されました。

ELISAアッセイでは、組織をPBS緩衝液に溶解し、製造業者のプロトコルに従って市販のELISAキット(R&D)を使用した。 ライセートは、市販のBCAタンパク質アッセイキットを使用して決定された総タンパク質含有量に対して正規化されました。

サイトカイン ビーズ アレイ (CBA) アッセイでは、GM-CSF、IL-2、および IFN-γ を除く上記のすべてのサイトカインを測定するヒト炎症性サイトカイン CBA キット (BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ) を使用しました。データは BDTM FACS キャリバー フローサイトメーターで取得しました。 両方のアッセイは、以下に説明するように修正された検量線を使用することを除いて、製造元の指示に従って実行されました。 すべての標準とサンプルは二重に測定されました。

目的 3. 血液中の好中球のサイトカイン発現プロファイルを調べます。 これを実行するために、研究者は CD11b+/CD66b/CD34/CD45 を用いたフローサイトメトリー染色によって末梢血好中球集団を調べます。次に、末梢血中の標的サイトカインを発現する好中球の割合を決定します。