Marcatore infiammatorio e fibrosi venosa preesistente per predire la mal-maturazione AVF

La fistola arterovenosa (AVF) è l'accesso vascolare preferito per l'emodialisi, che viene creata chirurgicamente ma collegando una vena superficiale all'arteria vicina e consentendo a questa vena di allargarsi e aumentare di diametro interno sotto la circolazione arteriosa. Il successo della maturazione della fistola dipende dalla dilatazione e dal rimodellamento dell'arteria e della vena, ma i vasi rigidi e ispessiti dei pazienti con malattie renali allo stadio terminale (ESRD) possono rispondere male ai segnali che promuovono questi adattamenti. Circa il 20-40% della maturazione della FAV fallisce e nessun trattamento efficace per prevenire il fallimento della maturazione della FAV. Paulson WD ha riassunto quattro punti per il fallimento della maturazione. Abilità chirurgica; malattia vascolare preesistente; Eventi a monte; ed eventi a valle. Gli eventi a monte sono i meccanismi che inizialmente causano lesioni all'endotelio (trauma chirurgico, shear stress emodinamico, lesione della parete del vaso causata da punture di aghi, ecc.). Gli eventi a valle sono le risposte al danno endoteliale (adesione dei leucociti, migrazione delle cellule muscolari lisce dalla media allo strato intimale, proliferazione della muscolatura liscia, ecc.). Tuttavia, gli eventi a monte ea valle sono passaggi importanti nel fallimento della maturazione, la malattia vascolare preesistente non dovrebbe essere trascurata in quanto pone le basi per ciò che segue. Le fibre di collagene mediale sono organizzate in unità lamellari e orientate circonferenzialmente con arricciature nei vasi sanguigni sani. Tuttavia, un contenuto di collagene mediale più elevato potrebbe essere più rigido e la capacità limitata di dilatarsi. Recentemente, le ricerche hanno dimostrato che la condizione di fibrosi preesistente nelle vene era associata alla maturazione.

L'infiammazione per l'impostazione della FAV può essere suddivisa in due parti: infiammazione locale e sistemica. Per l'infiammazione locale era stata indicata causata dal trauma della creazione della fistola e dall'ipossia locale; Per l'infiammazione sistemica, che si verifica a causa dell'uremia presente nei pazienti con insufficienza renale cronica. Studi recenti hanno suggerito che il fallimento della FAV fosse collegato all'infiammazione. Il grasso perivascolare dell'arteria può essere previsto per il successo della maturazione AVF. La lipectomia della vena cefalica è un metodo di routine durante la creazione di fistole arterovenose per emodialisi[9]. Tuttavia, pochi studi precedenti hanno confrontato la maturazione AVF tra il grasso perivascolare della vena cefalica o la rimozione durante l'intervento AVF.

Obiettivi specifici

Il successo della maturazione della fistola dipende dalla dilatazione e dal rimodellamento dell'arteria e della vena, ma i vasi rigidi e ispessiti dei pazienti con ESRD possono rispondere male ai segnali che promuovono questi adattamenti. Sebbene i nostri dati preliminari abbiano mostrato che la fibrosi vascolare preesistente aumentava nel fallimento degli AVF. Ma il ritrovamento necessita ancora di ulteriori verifiche. In questo studio, gli investigatori si concentreranno sulla scoperta di segni molecolari da correlare alla maturazione o al fallimento degli AVF. Lo studio comprende le seguenti sezioni:

1. Se la fibrosi vascolare esiste nei pazienti con FAV e la sua associazione con il fallimento della maturazione.
2. Se la fibrosi vascolare è associata all'infiammazione.
3. Esaminare l'espressione delle citochine dei neutrofili nel sangue.
4. Se il grasso perivascolare della vena cefalica è associato al fallimento della FAV

Obiettivo 1. Se la fibrosi vascolare esista nei pazienti con FAV e la sua associazione con il fallimento della maturazione. Gli investigatori osserveranno la fibrosi vascolare mediante istopatologia e western blot.

Innanzitutto i soggetti sono quei pazienti uremici adulti che subiranno una creazione di FAV. L'indagine arruolerà i pazienti con malattia renale cronica (CKD) stadio 5 (CKD-5) e stadio 6 (CKD-6) che avranno bisogno di emodialisi di mantenimento (HD). Gli investigatori utilizzeranno lo strumento di valutazione ecografica preoperatoria per confermare la fattibilità dei vasi del braccio per la creazione di un AVF nativo.

Come studio prospettico randomizzato controllato sulla conservazione o rimozione del grasso perivascolare durante l'intervento di FAV, un assistente dello studio aiuterà la randomizzazione e spiegherà il consenso informato al paziente. I soggetti vengono divisi casualmente in due gruppi: il gruppo sperimentale avrà il grasso perivascolare della vena cefalica bersaglio preservato il gruppo di controllo avrà il grasso rimosso prima dell'anastomosi AVF.

Il chirurgo preleverà il moncone della vena distale e 1 cm di grasso sottocutaneo per almeno 1,5 cm di lunghezza durante una creazione AVF, allo stesso tempo otterrà un campione di plasma di 10 cc. Il sondaggio arruolerà 100 pazienti adulti e li classificherà in gruppi in base a ciascuna maturazione AVF, JAS o FTM (vedere la definizione di seguito) entro 3-12 anni dopo l'intervento.

Valutazione ecografica vascolare preoperatoria.

Tutti i pazienti saranno sottoposti a esame clinico ed ecografico per valutare l'idoneità dell'intervento chirurgico, Il paziente sarà escluso Se le sue navi e / o condizioni cliniche non sono adatte all'emodialisi. Un punteggio di maturità della fistola arterovenosa per emodialisi (HDAVF) basato sulle seguenti tre misurazioni ultrasoniche oggettive. Assegna un punteggio riassuntivo compreso tra 0 e 9 punti. Punteggi più alti indicano più maturo. I parametri del test a ultrasuoni sono definiti come segue:

1. Misurazione del diametro dell'arteria del braccio e del flusso sanguigno totale. L'arteria brachiale è definita come misurata dai 4 prossimali (+/- 2,2 a 6) cm all'interno della linea curva del gomito, gli investigatori misureranno il diametro vascolare e stimeranno il flusso sanguigno totale dell'avambraccio.
2. La scansione dell'arteria radiale dell'avambraccio è definita come il diametro dell'arteria radiale scansionata dall'inizio della linea antecubitale fino alla linea del polso. Notare che, gli investigatori confermano anche il suo diametro> = 2,0 mm e non identificano stenosi evidenti della linea antecubitale al polso. Notare che, gli investigatori confermano anche il suo diametro> = 2,0 mm e non identificano alcuna stenosi evidente.
3. Misurare il diametro non aumentato della vena cefalica. Il suo punto medio è definito come il centro tra la linea del gomito e la linea del polso, che è di circa 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distalmente al gomito.
4. Misurare il diametro aumentato della vena cefalica. La pressione viene applicata temporaneamente alla parte superiore del braccio con il bracciale del laccio emostatico a 100 mm-Hg e che fornisce una resistenza moderata, attendere 30 secondi, quindi gli investigatori misurano la vena cefalica dove è stata definita sopra. Di conseguenza, la definizione di compliance venosa è definita come il grado di dilatazione venosa della vena cefalica prima e dopo l'aumento. Inoltre, la compliance della vena è definita come la percentuale di area della sezione trasversale aumentata/non aumentata della vena.
5. Gli investigatori confermeranno che l'intero segmento della vena cefalica deve avere un diametro > 2,0 mm e non identificheranno alcuna stenosi significativa.

Definizione di successo clinico: è definito come l'obiettivo HDAVF può essere utilizzato da due aghi e completare la sessione HD per almeno ⅔ delle sessioni di prescrizione in un mese. Un criterio minimo di una corsa è una velocità media del flusso sanguigno di 300 ml/min in una sessione HD di 3,5 ore per raggiungere un target sp-Kt/V di 1.2.14 In cui una sessione HD di successo è definita come il completamento della HD con una velocità di flusso di dialisi superiore a 200 ml/min e una durata della sessione di 4 ore o più.

Definizione di successo in base ai parametri ecografici: l'indagine propone un sistema di punteggio ecografico oggettivo e considera un punteggio totale di quattro o più come maturazione AVF.

Per l'analisi istologica, i campioni sono stati inclusi in paraffina e sezionati. H&E (ematossilina ed eosina) sono coloranti comuni usati in istologia. L'ematossilina colora i nuclei delle cellule in blu e l'eosina colora la matrice extracellulare e il citoplasma si presenta in rosa. La colorazione del pentacromo di Movat può dimostrare la presenza di collagene, elastina, mucina muscolare e fibrina nelle sezioni di tessuto. Gli investigatori usano la colorazione rosso Sirio per osservare le fibre di collagene I e III nelle sezioni di tessuto. Per rilevare i depositi di calcio, gli investigatori usano la colorazione rossa Alizan. La tricromica di Masson verrà utilizzata per la colorazione. Nella colorazione tricromica, la muscolatura liscia appare rossa e il collagene appare blu.

Per il saggio western blot, l'espressione di collagene, α-SMA, TIMP-1 e TIMP2 aumenterà nella fibrosi vascolare. Pertanto, i ricercatori rileveranno l'espressione di collagene, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 nella maturazione AVF e nel tessuto di fallimento. I tessuti sono stati omogeneizzati e lisati. La concentrazione proteica per ciascun estratto di tessuto è stata determinata utilizzando un saggio proteico BCA secondo le istruzioni del fornitore (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Cinquanta microgrammi di proteine ​​​​di lisati tissutali per corsia sono stati separati da SDS-PAGE in condizioni riducenti e asciugati su membrane PVDF (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Le membrane sono state bloccate in latte in polvere sgrassato al 5%/PBS/0,1% Tween-20 (PBST) e sono state quindi incubate con l'anticorpo primario per 1 ora. Le macchie sono state lavate 4 volte PBST e l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi (Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) è stato aggiunto (1:10.000) per un'altra ora. Infine, le membrane sono state lavate in PBST e il rilevamento dell'antigene è stato effettuato utilizzando il metodo di rilevamento della chemiluminescenza potenziato secondo le raccomandazioni del produttore

Obiettivo 2. Se la fibrosi vascolare è associata all'infiammazione. L'infiammazione nel contesto della FAV era coinvolta a livello locale e sistemico. Infiammazione locale causata da trauma della creazione di fistole e ipossia locale. Pertanto, i ricercatori misureranno IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5 (RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 e confronteranno l'espressione tra maturazione AVF e tessuto di fallimento mediante QPCR e Multiplex ELISA. Inoltre, l'infiammazione sistemica si verifica a causa dell'uremia che è presente nelle malattie renali croniche. Inoltre, gli investigatori rileveranno l'espressione di IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5 (RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 e confronteranno l'espressione tra la maturazione AVF e il siero di fallimento mediante analisi CBA.

Per il test QPCR, l'RNA è stato estratto dal tessuto venoso mediante il protocollo TRIzol (Life Technologies, Invitrogen). Le concentrazioni di RNA sono state quantificate da Nanodrop. La purezza dell'RNA totale estratto è stata determinata come rapporto 260/280 nm e l'integrità è stata controllata. La QPCR è stata eseguita dal sistema TaqMan.

Per il saggio ELISA, i tessuti sono stati lisati in tampone PBS e utilizzando kit ELISA commerciali (R&S) secondo il protocollo del produttore. I lisati sono stati normalizzati al contenuto proteico totale determinato utilizzando un kit di analisi proteica BCA commerciale.

Per il saggio Cytokine Bead Array (CBA), è stato utilizzato il kit CBA per citochine infiammatorie umane (BD Biosciences, San Jose, CA), che misura tutte le citochine di cui sopra eccetto GM-CSF, IL-2 e IFN-γ; i dati sono stati acquisiti su un citometro a flusso calibro BDTM FACS. Entrambi i test sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore, ad eccezione dell'uso di curve di calibrazione modificate come descritto di seguito. Tutti gli standard e i campioni sono stati misurati in duplicato.

Obiettivo 3. Esaminare il profilo di espressione delle citochine dei neutrofili nel sangue. Per eseguire ciò, i ricercatori esamineranno la popolazione di neutrofili del sangue periferico mediante colorazione della citometria a flusso con CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Avanti per determinare la percentuale di neutrofili che esprimono citochine bersaglio nel sangue periferico.