Inflammatoire marker en reeds bestaande veneuze fibrose om AVF Mal-maturatie te voorspellen

De arterioveneuze fistel (AVF) is de geprefereerde vasculaire toegang voor hemodialyse, die chirurgisch wordt gecreëerd maar een oppervlakkige ader verbindt met een nabijgelegen slagader en deze ader onder arteriële circulatie vergroot en in inwendige diameter vergroot. Succesvolle fistelrijping hangt af van dilatatie en hermodellering van de slagader en ader, maar de stijve en verdikte vaten van patiënten met terminale nierziekte (ESRD) reageren mogelijk slecht op signalen die deze aanpassingen bevorderen. Ongeveer 20 - 40% van de AVF-rijping mislukt en er is geen effectieve behandeling om AVF-rijpingsfalen te voorkomen. Paulson WD somde vier punten op voor het mislukken van de rijping. Chirurgische vaardigheid; reeds bestaande vaatziekte; Upstream-evenementen; en Downstream-evenementen. Stroomopwaartse gebeurtenissen zijn de mechanismen die aanvankelijk letsel aan het endotheel veroorzaken (chirurgisch trauma, hemodynamische schuifspanning, vaatwandletsel veroorzaakt door naaldprikken, enz.). Stroomafwaartse gebeurtenissen zijn de reacties op endotheelletsel (adhesie van leukocyten, migratie van gladde spiercellen van de media naar de intimale laag, proliferatie van gladde spieren, enz.). Stroomopwaartse en stroomafwaartse gebeurtenissen zijn echter belangrijke stappen in het falen van de rijping, reeds bestaande vasculaire aandoeningen mogen niet worden verwaarloosd, aangezien dit de weg vrijmaakt voor wat volgt. Mediale collageenvezels zijn georganiseerd in lamellaire eenheden en in de omtrek georiënteerd met plooien in gezonde bloedvaten. Een hoger mediaal collageengehalte kan echter stijver zijn en het vermogen om uit te zetten beperkt zijn. Onlangs hebben onderzoeken aangetoond dat reeds bestaande fibrose in aderen verband hield met rijping.

Ontsteking voor AVF-instelling kan in twee delen worden verdeeld: lokale en systemische ontsteking. Voor lokale ontsteking was aangegeven veroorzaakt door het trauma van fistelvorming en lokale hypoxie; Voor systemische ontsteking, die optreedt als gevolg van uremie die aanwezig is bij CKD-patiënten. Recent onderzoek heeft gesuggereerd dat AVF-falen verband houdt met ontsteking. Het perivasculaire vet van de slagader kan een succesvolle AVF-rijping voorspellen. Lipectomie van de cephalische ader is een routinemethode tijdens het creëren van arterioveneuze fistels door hemodialyse [9]. Er zijn echter maar weinig eerdere onderzoeken die AVF-rijping hebben vergeleken tussen perivasculair vet van de cephalische ader of verwijdering tijdens de AVF-operatie.

Specifieke doelen

Succesvolle fistelrijping hangt af van dilatatie en hermodellering van de slagader en ader, maar de stijve en verdikte vaten van ESRD-patiënten kunnen slecht reageren op signalen die deze aanpassingen bevorderen. Hoewel onze voorlopige gegevens aantoonden dat reeds bestaande vasculaire fibrose toenam bij AVF-falen. Maar de bevinding heeft nog meer verificaties nodig. In deze studie zullen onderzoekers zich concentreren op het vinden van moleculaire markeringen die verband houden met de rijping of het falen van AVF's. De studie omvat de volgende onderdelen:

1. Of vasculaire fibrose bestaat bij AVF-patiënten en de associatie met rijpingsfalen.
2. Of vasculaire fibrose geassocieerd is met ontsteking.
3. Onderzoek de cytokine-expressie van neutrofielen in bloed.
4. Of het perivasculaire vet van de cephalische ader geassocieerd is met AVF-falen

Doel 1. Of vasculaire fibrose bestaat bij AVF-patiënten en de associatie met rijpingsfalen. Onderzoekers zullen vasculaire fibrose observeren door middel van histopathologie en western blot.

Allereerst zijn de proefpersonen die volwassen uremische patiënten die een AVF-creatie zullen ondergaan. Het onderzoek zal de patiënten inschrijven met chronische nierziekte (CKD) stadium 5 (CKD-5) en stadium 6 (CKD-6) die onderhoud-hemodialyse (HD) nodig hebben. Onderzoekers zullen de preoperatieve echografie-beoordelingstool gebruiken om de haalbaarheid van de armvaten voor het creëren van een native AVF te bevestigen.

Als een prospectieve gerandomiseerde gecontroleerde studie van perivasculair vetbehoud of -verwijdering tijdens de AVF-operatie, zal een studieassistent helpen bij de randomisatie en de geïnformeerde toestemming aan de patiënt uitleggen. De proefpersonen worden willekeurig in twee groepen verdeeld: bij de experimentele groep wordt het perivasculaire vet van de doelhoofdader behouden, bij de controlegroep wordt het vet verwijderd vóór de AVF-anastomose.

De chirurg verzamelt de distale aderstomp en 1 cm onderhuids vet over een lengte van ten minste 1,5 cm tijdens een AVF-creatie, en neemt tegelijkertijd een plasmamonster van 10 cc. Het onderzoek zal 100 volwassen patiënten inschrijven en ze categoriseren in groepen volgens elke AVF-rijping, JAS of FTM (zie onderstaande definitie) met 3 - 12 na de operatie.

Preoperatieve vasculaire echografie.

Alle patiënten ondergaan een klinisch en echografisch onderzoek om de geschiktheid van een operatie te beoordelen. De patiënt wordt uitgesloten als zijn vaten en/of klinische toestand niet geschikt zijn voor hemodialyse. Een hemodialyse arterioveneuze fistel (HDAVF) volwassenheidsscore op basis van de volgende drie objectieve ultrasone metingen. Geef een samenvattend scorebereik van 0 tot 9 punten. Hogere scores wijzen op meer volwassenheid. Ultrasone testparameters worden als volgt gedefinieerd:

1. Het meten van de diameter van de armslagader en de totale bloedstroom. De armslagader wordt gedefinieerd als gemeten vanaf de proximale 4 (+/- 2,2 tot 6) cm binnen de gebogen lijn van de elleboog. Onderzoekers zullen de vasculaire diameter meten en de totale doorbloeding van de onderarm schatten.
2. Radiale slagaderscan van de onderarm wordt gedefinieerd als de diameter van de gescande radiale slagader vanaf het begin van de antecubitale tot aan de polslijn. Merk op dat de onderzoekers ook de diameter > = 2,0 mm bevestigen en geen duidelijke stenose van de antecubitale naar de polslijn identificeren. Merk op dat onderzoekers ook de diameter > = 2,0 mm bevestigen en geen duidelijke stenose vaststellen.
3. Meet de niet-vergrote diameter van de hoofdader. Het middelpunt ervan wordt gedefinieerd als het midden tussen de ellebooglijn en de polslijn, die ongeveer 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distaal van de elleboog ligt.
4. Meet de vergrote diameter van de hoofdader. Er wordt tijdelijk druk uitgeoefend op de bovenarm met een tourniquetmanchet tot 100 mm-Hg, wat een matige weerstand geeft. Wacht 30 seconden, waarna de onderzoekers de hoofdader meten op de plaats die hierboven is gedefinieerd. Dienovereenkomstig wordt de definitie van veneuze compliantie gedefinieerd als de mate van veneuze dilatatie van de vena cephalica voor en na augmentatie. Bovendien wordt de compliantie van de ader gedefinieerd als het percentage vergrote/niet-vergrote dwarsdoorsnede van de ader.
5. Onderzoekers zullen bevestigen dat het hele segment van de hoofdader een diameter van > 2,0 mm zal hebben en geen significante stenose zullen identificeren.

Definitie van klinisch succes: Het wordt gedefinieerd als het beoogde HDAVF dat kan worden gebruikt door twee naalden en de ZvH-sessie kan voltooien voor ten minste ⅔ van de voorschrijfsessies in een maand. Een minimumcriterium voor een run is een gemiddelde bloedstroomsnelheid van 300 ml/min in een 3,5 uur durende HD-sessie om een ​​sp-Kt/V doel van 1.2.14 te bereiken Waarbij een succesvolle HD-sessie wordt gedefinieerd als voltooiing van HD met een dialysestroomsnelheid van meer dan 200 ml/min en een sessieduur van 4 uur of meer.

Definitie van succes op basis van ultrasone parameters: het onderzoek stelt een objectief ultrasoon scoresysteem voor en beschouwt een totale score van vier of meer als AVF-rijping.

Voor histologische analyse werden monsters in paraffine ingebed en in secties verdeeld. H&E (hematoxyline en eosine) zijn veel voorkomende kleurstoffen die in de histologie worden gebruikt. Het hematoxyline kleurt celkernen is blauw en eosine kleurt de extracellulaire matrix en het cytoplasma wordt roze. Met de Movat pentachrome kleuring kan worden aangetoond dat collageen, elastine, spiermucine en fibrine in weefselsecties aanwezig zijn. Onderzoekers gebruiken Sirius-rode kleuring om de collageen I- en III-vezels in weefselsecties te observeren. Om kalkafzettingen te detecteren, gebruiken onderzoekers Alizan-rode kleuring. De trichroom van de Masson wordt gebruikt om te kleuren. In de trichroomkleuring lijkt glad spierweefsel rood en collageen blauw.

Voor de western blot-assay zal de expressie van collageen, α-SMA, TIMP-1 en TIMP2 toenemen bij vasculaire fibrose. Daarom zullen onderzoekers expressie van collageen, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 in AVF-rijping en falend weefsel detecteren. Weefsels werden gehomogeniseerd en gelyseerd. Eiwitconcentratie voor elk weefselextract werd bepaald met behulp van een BCA-eiwitassay volgens de instructies van de leverancier (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, VS). Vijftig microgram weefsellysaateiwit per baan werd gescheiden door SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden en geblot op PVDF-membranen (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, VS). Membranen werden geblokkeerd in 5% ontvette droge melk/PBS/0,1% Tween-20 (PBST) en werden vervolgens 1 uur geïncubeerd met het primaire antilichaam. Blots werden 4 keer PBST gewassen en het secundaire peroxidase-geconjugeerde antilichaam (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, VS) werd toegevoegd (1:10.000) gedurende nog een uur. Ten slotte werden membranen gewassen in PBST en werd detectie van het antigeen uitgevoerd met behulp van de verbeterde chemiluminescentiedetectiemethode volgens de aanbevelingen van de fabrikant

Doel 2. Of vasculaire fibrose geassocieerd is met ontsteking. Ontsteking in de setting van AVF was lokaal en systemisch betrokken. Lokale ontsteking veroorzaakt door trauma van fistelvorming en lokale hypoxie. Onderzoekers zullen dus de IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 meten en de expressie tussen AVF-rijping en falend weefsel vergelijken met QPCR en Multiplex ELISA. Daarnaast treedt systemische ontsteking op vanwege uremie die aanwezig is bij chronische nieraandoeningen. Onderzoekers zullen ook de expressie van IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 detecteren en expressie tussen AVF-rijping en faalserum vergelijken met CBA-assay.

Voor de QPCR-test werd RNA uit aderweefsel geëxtraheerd door het TRIzol-protocol (Life Technologies, Invitrogen). RNA-concentraties werden gekwantificeerd door Nanodrop. De zuiverheid van het totale geëxtraheerde RNA werd bepaald als de 260/280 nm-verhouding en de integriteit werd gecontroleerd. QPCR werd uitgevoerd door het TaqMan-systeem.

Voor ELISA-assay werden weefsels gelyseerd in PBS-buffer en met behulp van commerciële ELISA-kits (R&D) volgens het protocol van de fabrikant. De lysaten werden genormaliseerd tot het totale eiwitgehalte bepaald met behulp van een in de handel verkrijgbare BCA-eiwitassaykit.

Voor Cytokine Bead Array (CBA) -test werd de Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) gebruikt, die alle bovengenoemde cytokines meet behalve GM-CSF, IL-2 en IFN-γ; gegevens werden verkregen op een BDTM FACS kaliber flowcytometer. Beide assays werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, met uitzondering van het gebruik van gewijzigde kalibratiecurven zoals hieronder beschreven. Alle standaarden en monsters werden in duplo gemeten.

Doel 3. Onderzoek het cytokine-expressieprofiel van neutrofielen in bloed. Om dit uit te voeren, zullen onderzoekers de perifere bloedneutrofielenpopulatie onderzoeken door middel van flowcytometriekleuring met CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Vervolgens om het percentage neutrofielen te bepalen dat doelcytokines in perifeer bloed tot expressie brengt.