염증 마커 및 기존 정맥 섬유증을 예측하기 위한 AVF 불량 성숙

동정맥 누공(AVF)은 혈액 투석을 위한 선호되는 혈관 접근로로, 외과적으로 생성되지만 표재성 정맥을 인근 동맥에 연결하고 이 정맥이 확장되어 동맥 순환 하에서 내경이 증가하도록 합니다. 성공적인 누공 성숙은 동맥과 정맥의 확장 및 리모델링에 달려 있지만 말기 신장 질환(ESRD) 환자의 경직되고 두꺼워진 혈관은 이러한 적응을 촉진하는 신호에 제대로 반응하지 못할 수 있습니다. 약 20~40%의 AVF 성숙이 실패하고 AVF 성숙 실패를 예방하는 효과적인 치료법이 없습니다. Paulson WD는 성숙 실패에 대해 4가지 포인트를 요약했습니다. 외과 기술; 기존 혈관 질환; 업스트림 이벤트 및 다운스트림 이벤트. 업스트림 이벤트는 초기에 내피 손상을 유발하는 메커니즘입니다(외과적 외상, 혈역학적 전단 응력, 바늘 천자로 인한 혈관벽 손상 등). 다운스트림 이벤트는 내피 손상(백혈구 부착, 배지에서 내막층으로의 평활근 세포의 이동, 평활근 증식 등)에 대한 반응입니다. 그러나 업스트림 및 다운스트림 이벤트는 성숙 실패의 중요한 단계이며, 기존 혈관 질환은 다음 단계를 설정하므로 무시해서는 안 됩니다. 내측 콜라겐 섬유는 라멜라 단위로 구성되고 건강한 혈관에서 크림프와 함께 원주 방향으로 배열됩니다. 그러나 내측 콜라겐 함량이 높을수록 더 단단해지고 확장 능력이 제한될 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 정맥에 이미 존재하는 섬유증 상태는 성숙과 관련이 있습니다.

AVF 설정에 대한 염증은 국소 염증과 전신 염증의 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 누공 생성 및 국소 저산소증의 외상으로 인한 국소 염증이 나타났습니다. CKD 환자에게 존재하는 요독증으로 인해 발생하는 전신 염증의 경우. 최근 연구에 따르면 AVF 실패는 염증과 관련이 있습니다. 동맥의 혈관주위 지방은 성공적인 AVF 성숙을 예측할 수 있습니다. 두부정맥 지방절제술은 혈액투석 동정맥루 생성 시 일상적인 방법이다[9]. 그러나 AVF 수술 중 혈관주위 두정맥의 지방 또는 제거 사이의 AVF 성숙을 비교한 이전 연구는 거의 없습니다.

구체적인 목표

성공적인 누공 성숙은 동맥 및 정맥의 확장 및 리모델링에 달려 있지만 ESRD 환자의 뻣뻣하고 두꺼워진 혈관은 이러한 적응을 촉진하는 신호에 잘 반응하지 않을 수 있습니다. 우리의 예비 데이터에 따르면 기존 혈관 섬유증이 AVF 실패에서 증가한 것으로 나타났습니다. 그러나 결과는 여전히 더 많은 검증이 필요합니다. 이 연구에서 조사관은 AVF의 성숙 또는 실패와 관련된 분자 표지의 발견에 초점을 맞출 것입니다. 이 연구에는 다음 섹션이 포함됩니다.

1. AVF 환자에서 혈관 섬유증이 존재하는지 여부 및 성숙 실패와의 연관성.
2. 혈관 섬유증이 염증과 관련이 있는지 여부.
3. 혈액에서 호중구의 사이토카인 발현을 검사합니다.
4. 두정맥의 혈관주위 지방이 AVF 부전과 관련이 있는지 여부

목적 1. AVF 환자에서 혈관섬유화의 존재 여부 및 성숙부전과의 연관성. 조사관은 조직병리학 및 웨스턴 블롯에 의해 혈관 섬유증을 관찰할 것입니다.

우선, 주제는 AVF 생성을 겪게 될 성인 요독증 환자입니다. 이 설문 조사는 유지 관리-혈액 투석(HD)이 필요한 만성 신장 질환(CKD) 5기(CKD-5) 및 6기(CKD-6) 환자를 등록합니다. 수사관은 네이티브 AVF 생성을 위한 팔 혈관의 가능성을 확인하기 위해 수술 전 초음파 평가 도구를 사용할 것입니다.

AVF 수술 중 혈관주위 지방 보존 또는 제거에 대한 전향적 무작위 통제 시험으로서 연구 조교가 무작위 배정을 돕고 사전 동의를 환자에게 설명할 것입니다. 피험자는 무작위로 두 그룹으로 나뉩니다. 실험 그룹은 대상 두부 정맥의 혈관주위 지방을 보존하고 대조군은 AVF 문합 전에 지방을 제거합니다.

외과의는 AVF 생성 중에 최소 1.5cm 길이의 원위 정맥 그루터기와 1cm의 피하 지방을 채취하고 동시에 10cc 혈장 샘플을 얻습니다. 설문 조사는 100명의 성인 환자를 등록하고 수술 후 3 - 12까지 각 AVF 성숙도, JAS 또는 FTM(아래 정의 참조)에 따라 그룹으로 분류합니다.

수술 전 혈관 초음파 평가.

모든 환자는 수술의 적합성을 평가하기 위해 임상 및 초음파 검사를 받게 되며, 혈관 및/또는 임상 상태가 혈액 투석에 적합하지 않은 환자는 제외됩니다. 다음 세 가지 객관적인 초음파 측정을 기반으로 한 혈액 투석 동정맥 누공(HDAVF) 성숙도 점수. 0~9점 범위의 요약 점수를 제공합니다. 점수가 높을수록 성숙함을 나타냅니다. 초음파 테스트 매개변수는 다음과 같이 정의됩니다.

1. 팔 동맥 직경과 총 혈류량을 측정합니다. 상완 동맥은 팔꿈치의 곡선 라인 내에서 근위 4(+/- 2,2 ~ 6) cms에서 측정된 것으로 정의되며 조사관은 혈관 직경을 측정하고 총 팔뚝 혈류량을 추정합니다.
2. 팔뚝의 요골동맥 스캔은 상완의 시작 부분에서 손목.선까지 스캔된 요골동맥의 직경으로 정의됩니다. 특히 조사관은 직경> = 2.0mm를 확인하고 손목 라인에 대한 전주근의 명백한 협착을 식별하지 않습니다. 특히 조사관은 직경> = 2.0mm를 확인하고 명백한 협착증을 식별하지 않습니다.
3. 두부 정맥의 확장되지 않은 직경을 측정합니다. 그것의 중점은 팔꿈치 라인과 손목 라인 사이의 중간으로 정의되며 팔꿈치에서 말단으로 약 10(+/- 2, 8 ~ 12) cms입니다.
4. 두부 정맥의 확대된 직경을 측정합니다. 일시적으로 지혈대로 상완에 100mmHg의 압력을 가하고 적당한 저항을 제공하고 30초간 기다린 다음 조사관은 위에서 정의한 두부 정맥을 측정합니다. 따라서 정맥 순응도의 정의는 확장 전후의 두부정맥의 확장정도로 정의한다. 또한, 정맥의 순응도는 정맥의 확대/비확대 단면적의 백분율로 정의됩니다.
5. 조사관은 두부 정맥의 전체 부분이 직경이 > 2.0mm이고 심각한 협착이 없는지 확인합니다.

임상적 성공의 정의: 목표 HDAVF가 2개의 바늘로 사용될 수 있고 한 달에 처방 세션의 최소 ⅔ 동안 HD 세션을 완료할 수 있는 것으로 정의됩니다. 실행의 최소 기준은 목표 sp-Kt/V 1.2.14를 달성하기 위한 3.5시간 HD 세션에서 평균 혈류 속도 300ml/분입니다. 성공적인 HD 세션은 투석 유속이 200 ml/min 이상이고 세션 지속 시간이 4시간 이상인 HD의 완료로 정의됩니다.

초음파 매개변수에 의한 성공의 정의: 설문조사는 객관적인 초음파 채점 시스템을 제안하고 총점 4점 이상을 AVF 성숙으로 간주합니다.

조직학 분석을 위해 샘플을 파라핀 포매하고 절편화했습니다. H&E(헤마톡실린 및 에오신)는 조직학에서 사용되는 일반적인 염색입니다. 헤마톡실린은 세포핵을 파란색으로 염색하고 에오신은 세포외 기질을 염색하고 세포질은 분홍색을 나타냅니다. Movat 펜타크롬 염색은 조직 섹션에서 콜라겐, 엘라스틴, 근육 뮤신 및 피브린을 입증할 수 있습니다. 조사관은 Sirius-red 염색을 사용하여 조직 섹션에서 콜라겐 I 및 III 섬유를 관찰합니다. 칼슘 침전물을 검출하기 위해 조사관은 Alizan red 염색을 사용합니다. Masson의 trichrome은 염색에 사용됩니다. 트리크롬 염색에서 평활근은 빨간색으로 나타나고 콜라겐은 파란색으로 나타납니다.

웨스턴 블롯 분석의 경우 콜라겐, α-SMA, TIMP-1 및 TIMP2 발현이 혈관 섬유증에서 증가합니다. 따라서 연구자들은 AVF 성숙 및 실패 조직에서 콜라겐, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2의 발현을 감지할 것입니다. 조직을 균질화하고 용해시켰다. 각 조직 추출물에 대한 단백질 농도는 공급업체(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)의 지침에 따라 BCA 단백질 분석을 사용하여 결정되었습니다. 레인당 50 마이크로그램의 조직 용해물 단백질을 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 분리하고 PVDF 막(Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA) 상에 블롯팅하였다. 막을 5% 탈지 분유/PBS/0.1% Tween-20(PBST)에서 차단한 다음 1시간 동안 1차 항체와 함께 배양했습니다. 블롯을 PBST로 4회 세척하고, 2차 과산화효소 결합 항체(Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA)를 1시간 더 추가했습니다(1:10,000). 마지막으로 막을 PBST로 세척하고 제조사의 권고에 따라 강화된 화학발광 검출 방법을 사용하여 항원 검출을 수행하였다.

목표 2. 혈관 섬유화와 염증의 연관성 여부. AVF 설정의 염증은 국소적으로 그리고 전신적으로 관련되었습니다. 누공 생성의 외상 및 국소 저산소증으로 인한 국소 염증. 따라서 조사관은 IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9(MIG), CCL2(MCP1), IP10을 측정하고 AVF 성숙과 실패 조직 간의 발현을 QPCR 및 Multiplex ELISA로 비교할 것입니다. 게다가 전신 염증은 만성 신장 질환에 존재하는 요독증 때문에 발생한다. 또한 조사관은 IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9(MIG), CCL2(MCP1), IP10의 발현을 감지하고 CBA 분석을 통해 AVF 성숙과 실패 혈청 간의 발현을 비교할 것입니다.

QPCR 분석을 위해 TRIzol 프로토콜(Life Technologies, Invitrogen)에 의해 정맥 조직에서 RNA를 추출했습니다. RNA 농도는 Nanodrop에 의해 정량화되었습니다. 추출된 전체 RNA의 순도는 260/280 nm 비율로 결정되었으며 무결성을 확인했습니다. QPCR은 TaqMan 시스템에 의해 수행되었습니다.

ELISA 검정을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 ELISA 키트(R&D)를 사용하여 PBS 완충액에서 조직을 용해시켰다. 상업용 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 결정된 총 단백질 함량에 대해 용해물을 정규화했습니다.

CBA(Cytokine Bead Array) 분석을 위해 GM-CSF, IL-2 및 IFN-γ를 제외한 위의 모든 사이토카인을 측정하는 Human Inflammatory Cytokines CBA Kit(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용했습니다. 데이터는 BDTM FACS 구경 유세포 분석기에서 획득했습니다. 아래에 설명된 대로 수정된 보정 곡선을 사용하는 것을 제외하고 제조업체의 지침에 따라 두 분석을 모두 수행했습니다. 모든 표준 및 샘플은 이중으로 측정되었습니다.

목표 3. 혈액 내 호중구의 사이토카인 발현 양상을 조사한다. 이를 수행하기 위해 조사관은 CD11b+/CD66b/CD34/CD45로 유세포 분석 염색을 통해 말초 혈액 호중구 집단을 검사합니다. 다음으로 말초 혈액에서 표적 사이토카인을 발현하는 호중구의 백분율을 결정합니다.