Маркер воспаления и ранее существовавший венозный фиброз для прогнозирования мальформации АВФ

Артериовенозная фистула (АВФ) является предпочтительным сосудистым доступом для гемодиализа, который создается хирургическим путем, но соединяет поверхностную вену с близлежащей артерией и позволяет этой вене расширяться и увеличиваться во внутреннем диаметре при артериальном кровообращении. Успешное созревание фистулы зависит от расширения и ремоделирования артерии и вены, но жесткие и утолщенные сосуды у пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности (ТХПН) могут плохо реагировать на сигналы, которые способствуют этой адаптации. Около 20-40% АВФ не созревают, и не существует эффективного лечения для предотвращения недостаточности созревания АВФ. Полсон В.Д. суммировал четыре балла за нарушение созревания. Хирургическое мастерство; ранее существовавшие сосудистые заболевания; Восходящие события; и последующие события. Восходящие события представляют собой механизмы, которые первоначально вызывают повреждение эндотелия (хирургическая травма, гемодинамическое напряжение сдвига, повреждение стенки сосуда, вызванное проколами иглы и т. д.). Нисходящие события представляют собой ответы на повреждение эндотелия (адгезия лейкоцитов, миграция гладкомышечных клеток из медии в интимальный слой, пролиферация гладкомышечных клеток и т. д.). Тем не менее, восходящие и нисходящие события являются важными шагами в нарушении созревания, не следует пренебрегать ранее существовавшим сосудистым заболеванием, поскольку оно закладывает основу для последующего развития. Медиальные коллагеновые волокна организованы в пластинчатые единицы и ориентированы по окружности с извитыми связками в здоровых кровеносных сосудах. Однако более высокое содержание медиального коллагена может быть более жестким и ограничивать способность к расширению. Недавние исследования показали, что ранее существовавший фиброз в венах был связан с созреванием.

Воспаление при постановке АВФ можно разделить на две части: местное и системное воспаление. На местное воспаление указывалось, вызванное травмой образования свищей и местной гипоксией; При системном воспалении, возникающем из-за уремии у пациентов с ХБП. Недавнее исследование показало, что недостаточность АВФ связана с воспалением. По периваскулярному жиру артерии можно прогнозировать успешное созревание АВФ. Липэктомия головной вены является рутинным методом при создании гемодиализной артериовенозной фистулы [9]. Тем не менее, несколько предыдущих исследований сравнивали созревание АВФ между периваскулярным жиром головной вены и удалением во время операции на АВФ.

Конкретные цели

Успешное созревание фистулы зависит от расширения и ремоделирования артерии и вены, но жесткие и утолщенные сосуды у пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности могут плохо реагировать на сигналы, которые способствуют этой адаптации. Хотя наши предварительные данные показали, что ранее существовавший сосудистый фиброз увеличивался при недостаточности АВФ. Но открытие все еще нуждается в дополнительных проверках. В этом исследовании исследователи сосредоточатся на обнаружении молекулярных меток, связанных с созреванием или отказом АВФ. В исследование входят следующие разделы:

1. Существует ли сосудистый фиброз у пациентов с АВФ и его связь с нарушением созревания.
2. Связан ли сосудистый фиброз с воспалением.
3. Изучить экспрессию цитокинов нейтрофилов в крови.
4. Связан ли периваскулярный жир головной вены с недостаточностью АВФ

Цель 1. Существует ли сосудистый фиброз у пациентов с АВФ и его связь с нарушением созревания. Исследователи будут наблюдать сосудистый фиброз с помощью гистопатологии и вестерн-блоттинга.

Прежде всего, субъектами являются те взрослые пациенты с уремией, которым предстоит создание АВФ. В обследование будут включены пациенты с хронической болезнью почек (ХБП) 5-й (ХБП-5) и 6-й стадии (ХБП-6), нуждающиеся в поддерживающем гемодиализе (ГД). Исследователи будут использовать инструмент предоперационной ультразвуковой оценки, чтобы подтвердить возможность использования сосудов руки для создания нативной АВФ.

В качестве проспективного рандомизированного контролируемого исследования по сохранению или удалению периваскулярного жира во время операции на АВФ ассистент-исследователь будет помогать в рандомизации и объяснять информированное согласие пациента. Субъектов случайным образом делят на две группы: в экспериментальной группе периваскулярный жир целевой головной вены сохраняется, а в контрольной группе жир удаляется до наложения анастомоза АВФ.

Хирург возьмет культю дистальной вены и 1 см подкожного жира на длину не менее 1,5 см во время создания АВФ, в то же время получит 10-кубовый образец плазмы. В опросе примут участие 100 взрослых пациентов, которые будут разделены на группы в соответствии с созреванием АВФ, JAS или FTM (см. определение ниже) через 3–12 лет после операции.

УЗИ сосудов перед операцией.

Все пациенты будут проходить клиническое и ультразвуковое обследование для оценки пригодности операции. Пациент будет исключен, если его сосуды и / или клиническое состояние не подходят для гемодиализа. Оценка зрелости гемодиализной артериовенозной фистулы (HDAVF), основанная на следующих трех объективных ультразвуковых измерениях. Дайте суммарную оценку в диапазоне от 0 до 9 баллов. Более высокие баллы указывают на более зрелый характер. Параметры ультразвукового исследования определяются следующим образом:

1. Измерение диаметра артерии руки и общего кровотока. Плечевая артерия определяется как измеренная от проксимальных 4 (+/- 2,2 до 6) см в пределах изогнутой линии локтя. Исследователи измерят диаметр сосуда и оценят общий кровоток предплечья.
2. Сканирование лучевой артерии предплечья определяется как диаметр лучевой артерии, сканируемый от начала локтевой кости до линии запястья. Примечательно, что исследователи также подтверждают его диаметр> = 2,0 мм и не выявляют явного стеноза по антекубитальной линии запястья. Примечательно, что исследователи также подтверждают его диаметр> = 2,0 мм и не выявляют явного стеноза.
3. Измерьте нерасширенный диаметр головной вены. Его середина определяется как середина между линией локтя и линией запястья, которая находится примерно на 10 (+/- 2, 8 ~ 12) см дистальнее локтя.
4. Измерьте увеличенный диаметр головной вены. К плечу с помощью турникетной манжеты временно прикладывают давление до 100 мм рт. ст., которое оказывает умеренное сопротивление, выжидают 30 секунд, затем исследователи измеряют головную вену в месте, указанном выше. Соответственно определение венозной податливости определяется как степень венозной дилатации головной вены до и после аугментации. Кроме того, податливость вены определяется как процент увеличенной/нерастянутой площади поперечного сечения вены.
5. Исследователи подтвердят, что весь сегмент головной вены должен быть > 2,0 мм в диаметре и не выявят значительного стеноза.

Определение клинического успеха: он определяется как целевая HDAVF, которую можно использовать двумя иглами и завершить сеанс HD по крайней мере ⅔ назначенных сеансов в месяц. Минимальный критерий бега — при средней скорости кровотока 300 мл/мин при 3,5-часовом сеансе ГД достичь целевого значения sp-Kt/V 1,2.14. При котором успешным сеансом ГД считается завершение ГД со скоростью диализного потока более 200 мл/мин и длительностью сеанса 4 часа и более.

Определение успеха по ультразвуковым параметрам: в обзоре предлагается объективная система ультразвуковой оценки, а общий балл четыре и более считается созреванием АВФ.

Для гистологического анализа образцы заливали парафином и делали срезы. H&E (гематоксилин и эозин) являются обычными красителями, используемыми в гистологии. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин окрашивает внеклеточный матрикс и цитоплазму в розовый цвет. Окрашивание пентахромом Мовата позволяет продемонстрировать наличие коллагена, эластина, мышечного муцина и фибрина в срезах тканей. Исследователи используют окрашивание сириус-красным для наблюдения за волокнами коллагена I и III в срезах тканей. Для обнаружения отложений кальция исследователи используют окрашивание Ализаном красным. Для окрашивания будет использоваться трихром Массона. При окраске трихромом гладкие мышцы выглядят красными, а коллаген — синими.

Для вестерн-блоттинга экспрессия коллагена, α-SMA, TIMP-1 и TIMP2 будет увеличиваться при сосудистом фиброзе. Следовательно, исследователи обнаружат экспрессию коллагена, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 в ткани созревания и отказа АВФ. Ткани гомогенизировали и лизировали. Концентрацию белка для каждого тканевого экстракта определяли с помощью анализа белка BCA в соответствии с инструкциями поставщика (Pierce Chemical Co., Рокфорд, Иллинойс, США). Пятьдесят микрограмм белка лизата ткани на дорожку разделяли с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и наносили на мембраны PVDF (Millipore Corp., Бедфорд, Массачусетс, США). Мембраны блокировали в 5% обезжиренном сухом молоке/PBS/0,1% Tween-20 (PBST) и затем инкубировали с первичным антителом в течение 1 часа. Блоты промывали 4 раза PBST и добавляли вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) (1:10000) еще на час. Наконец, мембраны промывали в PBST и проводили обнаружение антигена методом усиленной хемилюминесцентной детекции в соответствии с рекомендациями производителя.

Цель 2. Связан ли сосудистый фиброз с воспалением. Воспаление на фоне АВФ было локальным и системным. Местное воспаление, вызванное травмой образования свища и локальной гипоксией. Таким образом, исследователи будут измерять IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5 (RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 и сравнивать экспрессию между созреванием AVF и тканью отказа с помощью QPCR и Multiplex ELISA. Кроме того, системное воспаление возникает из-за уремии, которая присутствует при хронических заболеваниях почек. Кроме того, исследователи обнаружат экспрессию IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 и сравнит экспрессию между созреванием AVF и сывороткой отказа с помощью анализа CBA.

Для анализа КПЦР РНК экстрагировали из ткани вены по протоколу TRIzol (Life Technologies, Invitrogen). Концентрации РНК определяли количественно с помощью Nanodrop. Чистоту всей выделенной РНК определяли по соотношению 260/280 нм и проверяли целостность. КПЦР проводили с помощью системы TaqMan.

Для анализа ELISA ткани лизировали в буфере PBS и с использованием коммерческих наборов ELISA (R&D) в соответствии с протоколом производителя. Лизаты нормализовали по содержанию общего белка, определенному с использованием коммерческого набора для анализа белка BCA.

Для анализа Cytokine Bead Array (CBA) использовали набор Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), который измеряет все вышеперечисленные цитокины, кроме GM-CSF, IL-2 и IFN-γ; данные были получены на проточном цитометре калибра BDTM FACS. Оба анализа были выполнены в соответствии с инструкциями производителя, за исключением использования модифицированных калибровочных кривых, как описано ниже. Все стандарты и образцы измеряли в двух повторностях.

Цель 3. Изучить профиль экспрессии цитокинов нейтрофилов в крови. Для этого исследователи изучат популяцию нейтрофилов периферической крови с помощью окрашивания методом проточной цитометрии CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Далее определяют процент нейтрофилов, экспрессирующих целевые цитокины, в периферической крови.