Zánětlivý marker a již existující žilní fibróza k předpovědi malturace AVF

Arteriovenózní píštěl (AVF) je preferovaným cévním přístupem pro hemodialýzu, který je vytvořen chirurgicky, ale spojuje povrchovou žílu s blízkou tepnou a umožňuje této žíle zvětšit se a zvětšit její vnitřní průměr pod arteriální cirkulací. Úspěšné zrání píštěle závisí na dilataci a remodelaci tepny a žíly, ale ztuhlé a ztluštělé cévy pacientů v konečném stadiu renálního onemocnění (ESRD) mohou špatně reagovat na signály, které tyto adaptace podporují. Asi 20 - 40 % zrání AVF selže a neexistuje žádná účinná léčba, která by zabránila selhání zrání AVF. Paulson WD shrnul čtyři body za selhání zrání. Chirurgická dovednost; preexistující vaskulární onemocnění; Upstream události; a následné události. Upstream události jsou mechanismy, které zpočátku způsobují poranění endotelu (chirurgické trauma, hemodynamické smykové napětí, poranění cévní stěny způsobené vpichy jehlou atd.). Downstream události jsou reakce na poškození endotelu (adheze leukocytů, migrace buněk hladkého svalstva z média do vnitřní vrstvy, proliferace hladkého svalstva atd.). Události upstream a downstream jsou však důležitými kroky při selhání dozrávání. Preexistující vaskulární onemocnění by nemělo být opomíjeno, protože připravuje půdu pro to, co následuje. Mediální kolagenová vlákna jsou organizována do lamelárních jednotek a orientována po obvodu se záhyby ve zdravých krevních cévách. Vyšší obsah mediálního kolagenu však může být tužší a omezená schopnost dilatace. Nedávno výzkumy ukázaly, že již existující stav fibrózy v žilách byl spojen s dozráváním.

Zánět pro nastavení AVF lze rozdělit na dvě části: lokální a systémový zánět. Byl indikován lokální zánět způsobený traumatem tvorby píštěle a lokální hypoxie; Pro systémový zánět, ke kterému dochází v důsledku urémie přítomné u pacientů s CKD. Nedávná studie naznačila, že selhání AVF bylo spojeno se zánětem. Perivaskulární tuk arterie může být predikován úspěšným AVF maturace. Lipektomie cefalické žíly je rutinní metodou při hemodialyzační tvorbě arteriovenózní píštěle[9]. Několik předchozích studií však porovnávalo zrání AVF mezi perivaskulárním tukem cefalické žíly nebo odstraněním během operace AVF.

Konkrétní cíle

Úspěšné zrání píštěle závisí na dilataci a remodelaci tepny a žíly, ale ztuhlé a zesílené cévy pacientů s ESRD mohou špatně reagovat na signály, které tyto adaptace podporují. Ačkoli naše předběžná data ukázala, že již existující vaskulární fibróza se zvýšila při selhání AVF. Nález ale ještě potřebuje další ověření. V této studii se vyšetřovatelé zaměří na nalezení molekulárních značek souvisejících s dozráváním nebo selháním AVF. Studie obsahuje následující sekce:

1. Zda existuje vaskulární fibróza u pacientů s AVF a její souvislost se selháním maturace.
2. Zda je vaskulární fibróza spojena se zánětem.
3. Vyšetřte expresi cytokinů neutrofilů v krvi.
4. Zda perivaskulární tuk cefalické žíly souvisí se selháním AVF

Cíl 1. Zda existuje vaskulární fibróza u pacientů s AVF a její souvislost se selháním maturace. Badatelé budou sledovat vaskulární fibrózu histopatologií a western blotem.

Za prvé, subjekty jsou ti dospělí uremičtí pacienti, kteří podstoupí vytvoření AVF. Do průzkumu budou zařazeni pacienti s chronickým onemocněním ledvin (CKD) stadia 5 (CKD-5) a stadia 6 (CKD-6), kteří budou potřebovat udržovací hemodialýzu (HD). Vyšetřovatelé použijí nástroj pro předoperační ultrazvukové hodnocení k potvrzení proveditelnosti cév paže pro vytvoření nativní AVF.

Jako prospektivní randomizovaná kontrolovaná studie zachování nebo odstranění perivaskulárního tuku během operace AVF pomůže s randomizací asistent studie a vysvětlí informovaný souhlas pacienta. Subjekty jsou náhodně rozděleny do dvou skupin: experimentální skupině bude zachován perivaskulární tuk cílové cefalické žíly, kontrolní skupině bude odstraněn tuk před AVF anastomózou.

Chirurg během tvorby AVF odebere pahýl distální žíly a 1 cm podkožního tuku o délce alespoň 1,5 cm a současně získá 10 ml vzorku plazmy. Do průzkumu bude zařazeno 100 dospělých pacientů a kategorizováni do skupin podle každé AVF maturace, JAS nebo FTM (viz definice níže) do 3-12 po operaci.

Předoperační ultrazvukové vyšetření cév.

Všichni pacienti podstoupí klinické a ultrazvukové vyšetření k posouzení vhodnosti operace. Pacient bude vyloučen, pokud jeho cévy a/nebo klinický stav nejsou vhodné pro hemodialýzu. Skóre zralosti hemodialyzační arteriovenózní píštěle (HDAVF) na základě následujících tří objektivních ultrazvukových měření. Uveďte souhrnné skóre v rozsahu od 0 do 9 bodů. Vyšší skóre znamená zralejší. Parametry ultrazvukového testování jsou definovány takto:

1. Měření průměru tepny paže a celkového průtoku krve. Pažní tepna je definována jako měřená od proximálních 4 (+/- 2,2 až 6) cm v zakřivené linii lokte. Vyšetřovatelé změří vaskulární průměr a odhadnou celkový průtok krve předloktím.
2. Snímek radiální tepny předloktí je definován jako průměr radiální tepny snímané od začátku předloktí k linii zápěstí. Je třeba poznamenat, že vyšetřovatelé také potvrdili jeho průměr > = 2,0 mm a nezjistili žádnou zjevnou stenózu antekubitální k linii zápěstí. Je třeba poznamenat, že vyšetřovatelé také potvrdili jeho průměr > = 2,0 mm a nezjistili žádnou zjevnou stenózu.
3. Změřte nezvětšený průměr cefalické žíly. Jeho střed je definován jako střed mezi linií lokte a linií zápěstí, která je asi 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distálně od lokte.
4. Změřte zvětšený průměr cefalické žíly. Tlak je aplikován na horní část paže pomocí turniketové manžety na 100 mm Hg dočasně a která poskytuje mírný odpor, počkejte 30 sekund, poté vyšetřovatelé změří cefalickou žílu, kde byla definována výše. V souladu s tím je definice žilní poddajnosti definována jako stupeň žilní dilatace cefalické žíly před a po augmentaci. Dále je poddajnost žíly definována jako procento zvětšené / nezvětšené plochy průřezu žíly.
5. Vyšetřovatelé potvrdí, že celý segment cefalické žíly má být > 2,0 mm v průměru a nezjistí žádnou významnou stenózu.

Definice klinického úspěchu: Je definován jako cílový HDAVF může být použit dvěma jehlami a dokončit HD sezení po dobu alespoň ⅔ předepisování za měsíc. Minimálním kritériem běhu je průměrná rychlost průtoku krve 300 ml/min při 3,5hodinovém HD sezení pro dosažení cílového sp-Kt/V 1,2,14 Ve kterém je úspěšná HD relace definována jako dokončení HD s dialyzačním průtokem vyšším než 200 ml/min a trváním relace 4 hodiny nebo více.

Definice úspěchu pomocí ultrazvukových parametrů: průzkum navrhuje objektivní ultrazvukový skórovací systém a považuje celkové skóre čtyři nebo více za zrání AVF.

Pro histologickou analýzu byly vzorky zality do parafinu a nařezány. H&E (hematoxylin a eosin) jsou běžná barviva používaná v histologii. Hematoxylin barví buněčná jádra modře a eosin barví extracelulární matrix a cytoplazmu růžově. Barvením Movat pentachromem lze prokázat, že kolagen, elastin, svalový mucin a fibrin v řezech tkání. Vyšetřovatelé používají barvení Siriusovou červení k pozorování vláken kolagenu I a III v řezech tkání. Aby bylo možné detekovat usazeniny vápníku, vyšetřovatelé používají barvení červení Alizan. K barvení bude použit Massonův trichrom. V trichromové skvrně se hladká svalovina jeví červeně a kolagen modře.

Pro test western blot se exprese kolagenu, a-SMA, TIMP-1 a TIMP2 zvýší při vaskulární fibróze. Vyšetřovatelé tedy budou detekovat expresi kolagenu, a-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 ve tkáni zrání a selhání AVF. Tkáně byly homogenizovány a lyžovány. Koncentrace proteinu pro každý tkáňový extrakt byla stanovena pomocí BCA proteinového testu podle pokynů dodavatele (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Padesát mikrogramů proteinu tkáňových lyzátů na dráhu bylo separováno pomocí SDS-PAGE za redukčních podmínek a blotováno na PVDF membrány (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Membrány byly blokovány v 5% odtučněném sušeném mléce/PBS/0,1% Tween-20 (PBST) a poté byly inkubovány s primární protilátkou po dobu 1 hodiny. Bloty byly promyty 4krát PBST a na další hodinu byla přidána sekundární protilátka konjugovaná s peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) (1:10 000). Nakonec byly membrány promyty v PBST a detekce antigenu byla provedena pomocí metody zesílené chemiluminiscenční detekce podle doporučení výrobce

Cíl 2. Zda je vaskulární fibróza spojena se zánětem. Zánět v prostředí AVF byl zapojen lokálně i systémově. Lokální zánět způsobený traumatem tvorby píštěle a lokální hypoxií. Vyšetřovatelé tedy změří IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 a porovnají expresi mezi tkání zrání AVF a selháním pomocí QPCR a Multiplex ELISA. Kromě toho k systémovému zánětu dochází v důsledku urémie, která je přítomna u chronických onemocnění ledvin. Vyšetřovatelé budou také detekovat expresi IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 a porovnávat expresi mezi AVF maturací a selháním séra pomocí CBA testu.

Pro QPCR test byla RNA extrahována z žilní tkáně protokolem TRIzol (Life Technologies, Invitrogen). Koncentrace RNA byly kvantifikovány pomocí Nanodrop. Čistota celkové extrahované RNA byla stanovena jako poměr 260/280 nm a byla zkontrolována integrita. QPCR byla provedena systémem TaqMan.

Pro test ELISA byly tkáně lyžovány v pufru PBS a za použití komerčních souprav ELISA (R&D) podle protokolu výrobce. Lyzáty byly normalizovány na celkový obsah proteinu stanovený pomocí komerční soupravy pro stanovení proteinu BCA.

Pro test Cytokine Bead Array (CBA) byla použita sada Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA), která měří všechny výše uvedené cytokiny kromě GM-CSF, IL-2 a IFN-y; data byla získána na průtokovém cytometru kalibru FACS BDTM. Oba testy byly provedeny podle pokynů výrobce s výjimkou použití modifikovaných kalibračních křivek, jak je popsáno níže. Všechny standardy a vzorky byly měřeny duplicitně.

Cíl 3. Zjistit profil exprese cytokinů neutrofilů v krvi. Za tímto účelem vyšetřovatelé vyšetří populaci neutrofilů v periferní krvi pomocí průtokové cytometrie barvením s CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Dále určit procento neutrofilů exprimujících cílové cytokiny v periferní krvi.