Inflammatorisk markør og allerede eksisterende venøs fibrose til at forudsige AVF-mal-modning

Den arteriovenøse fistel (AVF) er den foretrukne vaskulære adgang til hæmodialyse, som er kirurgisk skabt, men som forbinder en overfladisk vene til nærliggende arterie og tillader denne vene at forstørre og øge den indre diameter under arteriel cirkulation. Succesfuld fistelmodning afhænger af dilatation og ombygning af arterien og venen, men de stive og fortykkede kar hos patienter med nyresygdomme i slutstadiet (ESRD) kan reagere dårligt på signaler, der fremmer disse tilpasninger. Omkring 20 - 40% af AVFs modning mislykkes og ingen effektiv behandling for at forhindre AVF modningssvigt. Paulson WD opsummerede fire punkter for modningssvigt. Kirurgisk færdighed; allerede eksisterende vaskulær sygdom; Upstream begivenheder; og Downstream-begivenheder. Opstrømshændelser er de mekanismer, der initialt forårsager skade på endotelet (kirurgisk traume, hæmodynamisk forskydningsspænding, karvægsskade forårsaget af nålestik osv.). Nedstrømshændelser er reaktionerne på endotelbeskadigelse (leukocytadhæsion, migration af glatte muskelceller fra medierne til intimalaget, glatmuskelproliferation osv.). Opstrøms og nedstrøms hændelser er imidlertid vigtige trin i modningssvigt, allerede eksisterende vaskulær sygdom bør ikke negligeres, da den sætter scenen for det, der følger. Mediale kollagenfibre er organiseret i lamellære enheder og orienteret periferisk med krympninger i sunde blodkar. Højere medial kollagenindhold kan dog være stivere og begrænset evne til at udvide sig. For nylig har undersøgelser vist, at allerede eksisterende fibrosetilstand i vener var forbundet med modning.

Inflammation for AVF-indstilling kan opdeles i to dele: lokal og systemisk inflammation. For lokal betændelse var blevet indikeret forårsaget af traumer af fisteldannelse og lokal hypoxi; Til systemisk betændelse, som opstår på grund af uræmi hos CKD-patienter. Nylige undersøgelser har antydet, at AVF-svigt var forbundet med betændelse. Det perivaskulære fedt i arterien kan forudsiges vellykket AVF-modning. Lipektomi af cephalic vene er en rutinemetode under hæmodialyse arteriovenøs fistel skabelse[9]. Imidlertid har få tidligere undersøgelser sammenlignet AVF-modning mellem perivaskulært fedt fra cephalic vene eller fjernelse under AVF-operationen.

Specifikke mål

Succesfuld fistelmodning afhænger af dilatation og ombygning af arterien og venen, men de stive og fortykkede kar hos ESRD-patienter kan reagere dårligt på signaler, der fremmer disse tilpasninger. Selvom vores foreløbige data viste, at allerede eksisterende vaskulær fibrose steg i AVFs svigt. Men fundet kræver stadig flere verifikationer. I denne undersøgelse vil efterforskere fokusere på opdagelsen af ​​molekylære mærker, der er relateret til AVFs modning eller svigt. Undersøgelsen omfatter følgende afsnit:

1. Hvorvidt vaskulær fibrose eksisterer hos AVF-patienter og dens sammenhæng med modningssvigt.
2. Om vaskulær fibrose er forbundet med betændelse.
3. Undersøg cytokinekspressionen af ​​neutrofil i blodet.
4. Om det perivaskulære fedt i cephalic vene er forbundet med AVF-svigt

Mål 1. Hvorvidt vaskulær fibrose eksisterer hos AVF-patienter og dens sammenhæng med modningssvigt. Efterforskere vil observere vaskulær fibrose ved histopatologi og western blot.

Først og fremmest er emnerne de voksne uremiske patienter, som vil gennemgå en AVF-oprettelse. Undersøgelsen vil inkludere patienter med kronisk nyresygdom (CKD) stadium 5 (CKD-5) og stadium 6 (CKD-6), som skal have vedligeholdelseshæmodialyse (HD). Efterforskere vil bruge det præoperative ultralydsvurderingsværktøj til at bekræfte gennemførligheden af ​​armkarrene til at skabe en naturlig AVF.

Som et prospektivt randomiseret kontrolleret forsøg med perivaskulær fedtbevarelse eller fjernelse under AVF-operationen, vil en undersøgelsesassistent hjælpe med randomiseringen og forklare det informerede samtykke til patienten. Forsøgspersonerne er tilfældigt opdelt i to grupper: Forsøgsgruppen vil have det perivaskulære fedt fra den cephaliske målvene bevaret, kontrolgruppen vil få fjernet fedtet før AVF-anastomosen.

Kirurgen vil høste den distale venestump og 1 cm subkutant fedt i mindst 1,5 cm i længden under en AVF-oprettelse, samtidig med at han får en 10-cc plasmaprøve. Undersøgelsen vil indskrive 100 voksne patienter og kategorisere dem i grupper i henhold til hver AVF-modning, JAS eller FTM (se definition nedenfor) 3 - 12 efter operationen.

Præoperativ vaskulær ultralydsvurdering.

Alle patienter vil have en klinisk undersøgelse og ultralydsundersøgelse for at vurdere egnetheden af ​​operation. Patienten vil blive udelukket, hvis deres kar og/eller kliniske tilstand ikke er egnet til hæmodialyse. En hæmodialyse arteriovenøs fistel (HDAVF) modenhedsscore baseret på følgende tre objektive ultralydsmålinger. Giv en opsummerende score fra 0 til 9 point. Højere score indikerer mere moden. Ultralydstestparametre er defineret som følger:

1. Måling af armens arteriediameter og total blodgennemstrømning. Brachialisarterien er defineret som målt fra de proksimale 4 (+/- 2,2 til 6) cm inden for den buede linje af albuen. Efterforskerne vil måle den vaskulære diameter og estimere den samlede blodgennemstrømning i underarmen.
2. Radial arteriescanning af underarmen er defineret som diameteren af ​​den radiale arterie scannet fra starten af ​​antecubital til håndleddet. Det skal bemærkes, at efterforskere også bekræfter dens diameter > = 2,0 mm og identificerer ingen tydelig stenose af antecubital til håndleddet. Det skal bemærkes, at efterforskere også bekræfter dens diameter > = 2,0 mm og identificerer ingen åbenlys stenose.
3. Mål den ikke-augmenterede diameter af den cephalic vene. Midtpunktet af den er defineret som midten mellem albuelinjen og håndledslinjen, som er omkring 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distalt for albuen.
4. Mål den øgede diameter af den cephalic vene. Der påføres tryk på overarmen med tourniquet-manchet til 100 mm Hg midlertidigt, og som giver moderat modstand, vent 30 sekunder, derefter måler efterforskerne den cephalic-vene, hvor det er defineret ovenfor. I overensstemmelse hermed er definitionen af ​​venøs compliance defineret som graden af ​​venøs dilatation af cephalic vene før og efter augmentation. Ydermere defineres venens compliance som procentdelen af ​​forstørret/ikke-forøget tværsnitsareal af venen.
5. Efterforskere vil bekræfte, at hele segmentet af cephalic vene skal være > 2,0 mm i diameter og identificere ingen signifikant stenose.

Definition af klinisk succes: Det er defineret som målet HDAVF kan bruges af to nåle og fuldføre HD-sessionen i mindst ⅔ af ordinationssessioner på en måned. Et minimumskriterium for en kørsel er en gennemsnitlig blodgennemstrømningshastighed på 300 ml/min i en 3,5-timers HD-session for at opnå en mål-sp-Kt/V på 1.2.14 I hvilken en vellykket HD-session defineres som fuldførelse af HD med en dialyseflowhastighed på mere end 200 ml/min og en sessionsvarighed på 4 timer eller mere.

Definition af succes ved ultralydsparametre: Undersøgelsen foreslår et objektivt ultralydsscoringssystem og betragter en samlet score på fire eller mere som AVF-modning.

Til histologisk analyse blev prøverne indlejret i paraffin og snittet. H&E (hæmatoxylin og eosin) er almindelige pletter, der bruges i histologi. Hæmatoxylin-farver cellekerner er blå, og eosin farver den ekstracellulære matrix og cytoplasma præsenterer pink. Movat pentachrome-farvning kan påvises, at kollagen, elastin, muskelmucin og fibrin i vævssnit. Efterforskere bruger Sirius-rød farvning til at observere kollagen I- og III-fibrene i vævssnit. For at påvise kalkaflejringer bruger efterforskerne Alizan rød farvning. Masson's trichrome vil blive brugt til at farve. I trichrome-farven ser glat muskulatur rød ud, og kollagen ser blå ud.

Til western blot-assay vil kollagen-, α-SMA-, TIMP-1- og TIMP2-ekspression øges i vaskulær fibrose. Derfor vil efterforskere påvise ekspression af kollagen, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 i AVF-modnings- og svigtvæv. Væv blev homogeniseret og lyseret. Proteinkoncentrationen for hvert vævsekstrakt blev bestemt under anvendelse af et BCA-proteinassay ifølge instruktionerne fra leverandøren (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Halvtreds mikrogram vævslysatprotein pr. bane blev adskilt ved SDS-PAGE under reducerende betingelser og blottet på PVDF-membraner (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Membraner blev blokeret i 5% affedtet tørmælk/PBS/0,1% Tween-20 (PBST) og blev derefter inkuberet med det primære antistof i 1 time. Blots blev vasket 4 gange PBST, og det sekundære peroxidase-konjugerede antistof (Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) blev tilsat (1:10.000) i endnu en time. Til sidst blev membraner vasket i PBST, og påvisning af antigenet blev udført ved anvendelse af den forbedrede kemiluminescensdetektionsmetode i henhold til producentens anbefalinger

Mål 2. Om vaskulær fibrose er forbundet med inflammation. Inflammation i AVF-miljøet var involveret lokalt og systemisk. Lokal betændelse forårsaget af traumer af fisteldannelse og lokal hypoxi. Så efterforskerne vil måle IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 og sammenligne udtryk mellem AVF-modnings- og svigtvæv ved QPCR og Multiplex ELISA. Desuden opstår systemisk inflammation på grund af uræmi, der er til stede i kroniske nyresygdomme. Efterforskere vil også påvise ekspression af IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 og sammenligne ekspression mellem AVF-modnings- og fejlserum ved CBA-assay.

Til QPCR-assay blev RNA ekstraheret fra venevæv ved hjælp af TRIzol-protokollen (Life Technologies, Invitrogen). RNA-koncentrationer blev kvantificeret ved hjælp af Nanodrop. Renheden af ​​det ekstraherede totale RNA blev bestemt som forholdet 260/280 nm, og integriteten blev kontrolleret. QPCR blev udført af TaqMan-systemet.

Til ELISA-assay blev væv lyseret i PBS-buffer og under anvendelse af kommercielle ELISA-kits (R&D) i henhold til producentens protokol. Lysaterne blev normaliseret til det totale proteinindhold bestemt ved anvendelse af et kommercielt BCA-proteinassaykit.

Til Cytokine Bead Array (CBA) assay blev Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) brugt, som måler alle ovenstående cytokiner undtagen GM-CSF, IL-2 og IFN-y; data blev erhvervet på et BDTM FACS kaliber flowcytometer. Begge analyser blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner bortset fra brugen af ​​modificerede kalibreringskurver som beskrevet nedenfor. Alle standarder og prøver blev målt i to eksemplarer.

Mål 3. Undersøg cytokinekspressionsprofilen for neutrofile i blod. For at udføre dette vil efterforskere undersøge den perifere blod neutrofil population ved flowcytometri farvning med CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Dernæst bestemmes procentdelen af ​​neutrofiler, der udtrykker målcytokiner i perifert blod.