Entzündungsmarker und vorbestehende venöse Fibrose zur Vorhersage einer AVF-Fehlreifung

Die arteriovenöse Fistel (AVF) ist der bevorzugte Gefäßzugang für die Hämodialyse, die chirurgisch geschaffen wird, aber eine oberflächliche Vene mit einer nahe gelegenen Arterie verbindet und es dieser Vene ermöglicht, sich zu erweitern und ihren Innendurchmesser unter arterieller Zirkulation zu erhöhen. Eine erfolgreiche Fistelreifung hängt von der Dilatation und Remodellierung der Arterie und Vene ab, aber die steifen und verdickten Gefäße von Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD) reagieren möglicherweise schlecht auf Signale, die diese Anpassungen fördern. Etwa 20–40 % der AVFs schlagen fehl, und es gibt keine wirksame Behandlung, um das Reifungsversagen der AVFs zu verhindern. Paulson WD fasste vier Punkte für Reifungsfehler zusammen. Chirurgische Fähigkeiten; vorbestehende Gefäßerkrankung; Upstream-Ereignisse; und Downstream-Ereignisse. Upstream-Ereignisse sind die Mechanismen, die anfänglich eine Schädigung des Endothels verursachen (chirurgisches Trauma, hämodynamische Scherbelastung, Verletzung der Gefäßwand durch Nadelstiche usw.). Nachgelagerte Ereignisse sind die Reaktionen auf eine Endothelverletzung (Leukozytenadhäsion, Migration glatter Muskelzellen aus der Media in die Intimaschicht, Proliferation glatter Muskeln usw.). Vor- und nachgelagerte Ereignisse sind jedoch wichtige Schritte beim Reifungsversagen. Vorbestehende Gefäßerkrankungen sollten nicht vernachlässigt werden, da sie die Voraussetzungen für das Folgende schaffen. Mediale Kollagenfasern sind in lamellaren Einheiten organisiert und in Umfangsrichtung mit Crimps in gesunden Blutgefäßen orientiert. Ein höherer medialer Kollagengehalt kann jedoch steifer sein und die Fähigkeit zur Dilatation einschränken. Kürzlich haben Untersuchungen gezeigt, dass ein vorbestehender Fibrosezustand in Venen mit der Reifung verbunden war.

Die Entzündung für die AVF-Einstellung kann in zwei Teile unterteilt werden: lokale und systemische Entzündung. Denn es wurde eine lokale Entzündung angezeigt, die durch das Trauma der Fistelbildung und lokale Hypoxie verursacht wurde; Für systemische Entzündungen, die aufgrund von Urämie bei CNE-Patienten auftreten. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass ein AVF-Versagen mit einer Entzündung verbunden ist. Das perivaskuläre Fett der Arterie kann eine erfolgreiche AVF-Reifung vorhersagen. Die Lipektomie der Vena cephalica ist eine Routinemethode während der arteriovenösen Fistelbildung bei der Hämodialyse[9]. Einige frühere Studien haben jedoch die AVF-Reifung zwischen perivaskulärem Fett der Kopfvene oder der Entfernung während der AVF-Operation verglichen.

Spezifische Ziele

Eine erfolgreiche Fistelreifung hängt von der Dilatation und Remodellierung der Arterie und Vene ab, aber die steifen und verdickten Gefäße von ESRD-Patienten reagieren möglicherweise schlecht auf Signale, die diese Anpassungen fördern. Obwohl unsere vorläufigen Daten zeigten, dass die vorbestehende vaskuläre Fibrose bei AVFs-Versagen zunahm. Aber der Befund bedarf noch weiterer Überprüfungen. In dieser Studie werden sich die Ermittler auf das Auffinden von molekularen Markierungen konzentrieren, die mit der Reifung oder dem Versagen von AVFs zusammenhängen. Die Studie umfasst die folgenden Abschnitte:

1. Ob vaskuläre Fibrose bei AVF-Patienten besteht und ihre Assoziation mit Reifungsversagen.
2. Ob vaskuläre Fibrose mit Entzündungen assoziiert ist.
3. Untersuchen Sie die Zytokinexpression von Neutrophilen im Blut.
4. Ob das perivaskuläre Fett der Kopfvene mit AVF-Versagen assoziiert ist

Ziel 1. Ob vaskuläre Fibrose bei AVF-Patienten besteht und ihre Assoziation mit Reifungsversagen. Die Ermittler werden vaskuläre Fibrose durch Histopathologie und Western Blot beobachten.

Zuallererst handelt es sich bei den Probanden um erwachsene urämische Patienten, die sich einer AVF-Erzeugung unterziehen werden. In die Umfrage werden Patienten mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) Stadium 5 (CKD-5) und Stadium 6 (CKD-6) aufgenommen, die eine Erhaltungs-Hämodialyse (HD) benötigen. Die Ermittler werden das präoperative Ultraschall-Bewertungstool verwenden, um die Machbarkeit der Armgefäße für die Erstellung eines nativen AVF zu bestätigen.

Als prospektive randomisierte kontrollierte Studie zur perivaskulären Fetterhaltung oder -entfernung während der AVF-Operation hilft ein Studienassistent bei der Randomisierung und erklärt dem Patienten die Einverständniserklärung. Die Probanden werden zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt: Bei der experimentellen Gruppe wird das perivaskuläre Fett der Zielvene cephalica erhalten, bei der Kontrollgruppe wird das Fett vor der AVF-Anastomose entfernt.

Der Chirurg entnimmt während einer AVF-Erzeugung den distalen Venenstumpf und 1 cm subkutanes Fett mit einer Länge von mindestens 1,5 cm und erhält gleichzeitig eine 10-ml-Plasmaprobe. Die Umfrage umfasst 100 erwachsene Patienten und kategorisiert sie in Gruppen gemäß jeder AVF-Reifung, JAS oder FTM (siehe Definition unten) von 3 bis 12 nach der Operation.

Präoperative vaskuläre Ultraschallbeurteilung.

Alle Patienten werden einer klinischen und Ultraschalluntersuchung unterzogen, um die Eignung der Operation zu beurteilen. Der Patient wird ausgeschlossen, wenn seine Gefäße und/oder sein klinischer Zustand nicht für eine Hämodialyse geeignet sind. Ein Hämodialyse-Reifewert für arteriovenöse Fisteln (HDAVF) basierend auf den folgenden drei objektiven Ultraschallmessungen. Geben Sie einen Gesamtpunktzahlbereich von 0 bis 9 Punkten an. Höhere Punktzahlen bedeuten reifer. Ultraschallprüfparameter sind wie folgt definiert:

1. Messen des Armarteriendurchmessers und des Gesamtblutflusses. Die Arteria brachialis ist definiert als gemessen von den proximalen 4 (+/- 2,2 bis 6) cm innerhalb der gekrümmten Linie des Ellbogens. Die Ermittler messen den Gefäßdurchmesser und schätzen den gesamten Unterarmblutfluss.
2. Radialarterien-Scan des Unterarms ist definiert als der Durchmesser der Radialarterie, der vom Beginn der Ellenbeuge bis zur Handgelenkslinie gescannt wird. Bemerkenswerterweise bestätigen die Ermittler auch seinen Durchmesser > = 2,0 mm und stellen keine offensichtliche Stenose des Antekubitals bis zur Handgelenkslinie fest. Bemerkenswerterweise bestätigen die Ermittler auch seinen Durchmesser > = 2,0 mm und stellen keine offensichtliche Stenose fest.
3. Messen Sie den nicht vergrößerten Durchmesser der Kopfvene. Der Mittelpunkt davon ist definiert als die Mitte zwischen der Ellbogenlinie und der Handgelenklinie, die etwa 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distal zum Ellbogen liegt.
4. Messen Sie den vergrößerten Durchmesser der Kopfvene. Auf den Oberarm wird mit einer Tourniquet-Manschette vorübergehend ein Druck von 100 mm Hg ausgeübt, der einen mäßigen Widerstand bietet, 30 Sekunden warten, dann messen die Untersucher die Kopfvene an der oben definierten Stelle. Dementsprechend ist die Definition der venösen Compliance definiert als der Grad der venösen Dilatation der Kopfvene vor und nach der Augmentation. Darüber hinaus wird die Venennachgiebigkeit als Prozentsatz der vergrößerten/nicht vergrößerten Querschnittsfläche der Vene definiert.
5. Die Ermittler werden bestätigen, dass das gesamte Segment der Kopfvene einen Durchmesser von > 2,0 mm hat und keine signifikante Stenose feststellen.

Definition des klinischen Erfolgs: Es ist definiert als das Ziel HDAVF, das mit zwei Nadeln verwendet werden kann und die HD-Sitzung für mindestens ⅔ der Verschreibungssitzungen in einem Monat abschließt. Ein Mindestkriterium für einen Lauf ist eine durchschnittliche Blutflussrate von 300 ml/min in einer 3,5-stündigen HD-Sitzung, um einen Ziel-sp-Kt/V von 1,2,14 zu erreichen Dabei ist eine erfolgreiche HD-Sitzung definiert als Abschluss der HD mit einer Dialyseflussrate von mehr als 200 ml/min und einer Sitzungsdauer von 4 Stunden oder mehr.

Definition des Erfolgs durch Ultraschallparameter: Die Umfrage schlägt ein objektives Ultraschall-Bewertungssystem vor und betrachtet eine Gesamtpunktzahl von vier oder mehr als AVF-Reife.

Für die histologische Analyse wurden die Proben in Paraffin eingebettet und geschnitten. H&E (Hämatoxylin und Eosin) sind gängige Farbstoffe, die in der Histologie verwendet werden. Das Hämatoxylin färbt Zellkerne blau und Eosin färbt die extrazelluläre Matrix und das Zytoplasma präsentiert sich rosa. Mit der Movat-Pentachrom-Färbung lassen sich Kollagen, Elastin, Muskelmucin und Fibrin in Gewebeschnitten nachweisen. Die Forscher verwenden eine Sirius-Rot-Färbung, um die Kollagen-I- und -III-Fasern in Gewebeschnitten zu beobachten. Um Kalkablagerungen nachzuweisen, verwenden die Ermittler eine Alizan-Rot-Färbung. Das Trichrom von Masson wird zum Färben verwendet. In der Trichrom-Färbung erscheint glatter Muskel rot und Kollagen erscheint blau.

Für den Western-Blot-Assay wird die Expression von Kollagen, α-SMA, TIMP-1 und TIMP2 bei vaskulärer Fibrose zunehmen. Daher werden die Forscher die Expression von Kollagen, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 in AVF-Reifungs- und Versagensgewebe nachweisen. Gewebe wurden homogenisiert und lysiert. Die Proteinkonzentration für jeden Gewebeextrakt wurde unter Verwendung eines BCA-Proteinassays gemäß den Anweisungen des Lieferanten (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) bestimmt. Fünfzig Mikrogramm Gewebelysatprotein pro Spur wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt und auf PVDF-Membranen (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA) geblottet. Die Membranen wurden in 5 % entfetteter Trockenmilch/PBS/0,1 % Tween-20 (PBST) blockiert und dann 1 Stunde lang mit dem primären Antikörper inkubiert. Die Blots wurden viermal mit PBST gewaschen, und der sekundäre Peroxidase-konjugierte Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) wurde für eine weitere Stunde zugegeben (1:10.000). Abschließend wurden die Membranen in PBST gewaschen und der Nachweis des Antigens unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz-Nachweisverfahrens gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt

Ziel 2. Ob vaskuläre Fibrose mit Entzündung assoziiert ist. Die Entzündung im Setting von AVF war lokal und systemisch beteiligt. Lokale Entzündung, verursacht durch ein Trauma der Fistelbildung und lokale Hypoxie. Daher werden die Ermittler IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5 (RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 messen und die Expression zwischen AVF-Reifung und Versagensgewebe durch QPCR und Multiplex-ELISA vergleichen. Außerdem tritt eine systemische Entzündung aufgrund von Urämie auf, die bei chronischen Nierenerkrankungen vorhanden ist. Außerdem werden die Forscher die Expression von IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5 (RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 nachweisen und die Expression zwischen AVF-Reifung und Versagensserum durch CBA-Assay vergleichen.

Für den QPCR-Assay wurde RNA aus Venengewebe nach dem TRIzol-Protokoll (Life Technologies, Invitrogen) extrahiert. RNA-Konzentrationen wurden durch Nanodrop quantifiziert. Die Reinheit der extrahierten Gesamt-RNA wurde als 260/280 nm-Verhältnis bestimmt und die Integrität wurde überprüft. QPCR wurde mit dem TaqMan-System durchgeführt.

Für den ELISA-Assay wurden Gewebe in PBS-Puffer und unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits (F&E) gemäß dem Protokoll des Herstellers lysiert. Die Lysate wurden auf den Gesamtproteingehalt normalisiert, der unter Verwendung eines kommerziellen BCA-Protein-Assay-Kits bestimmt wurde.

Für den Cytokine Bead Array (CBA)-Assay wurde das Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) verwendet, das alle oben genannten Cytokine außer GM-CSF, IL-2 und IFN-γ misst; die Daten wurden auf einem Durchflusszytometer vom Kaliber BDTM FACS erfasst. Beide Assays wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung von modifizierten Kalibrierungskurven, wie unten beschrieben. Alle Standards und Proben wurden doppelt gemessen.

Ziel 3. Untersuchung des Zytokin-Expressionsprofils von Neutrophilen im Blut. Um dies durchzuführen, untersuchen die Forscher die Neutrophilenpopulation im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie-Färbung mit CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Als nächstes wird der Prozentsatz an Neutrophilen bestimmt, die Zielzytokine im peripheren Blut exprimieren.