Marcador inflamatorio y fibrosis venosa preexistente para predecir mal maduración de FAV

La fístula arteriovenosa (FAV) es el acceso vascular preferido para la hemodiálisis, que se crea quirúrgicamente pero conecta una vena superficial a una arteria cercana y permite que esta vena se agrande y aumente su diámetro interno bajo la circulación arterial. La maduración exitosa de la fístula depende de la dilatación y remodelación de la arteria y la vena, pero los vasos rígidos y engrosados ​​de los pacientes con enfermedades renales en etapa terminal (ESRD) pueden responder mal a las señales que promueven estas adaptaciones. Alrededor del 20 al 40 % de las FAV fallan en la maduración y no existe un tratamiento eficaz para prevenir el fracaso de la maduración de las FAV. Paulson WD resumió cuatro puntos para el fracaso de la maduración. Habilidad quirúrgica; enfermedad vascular preexistente; eventos aguas arriba; y eventos aguas abajo. Los eventos aguas arriba son los mecanismos que inicialmente causan la lesión del endotelio (trauma quirúrgico, esfuerzo de cizallamiento hemodinámico, lesión de la pared del vaso causada por pinchazos de agujas, etc.). Los eventos aguas abajo son las respuestas a la lesión endotelial (adherencia de leucocitos, migración de células de músculo liso desde la capa media a la capa íntima, proliferación de músculo liso, etc.). Sin embargo, los eventos aguas arriba y aguas abajo son pasos importantes en el fracaso de la maduración, la enfermedad vascular preexistente no debe descuidarse ya que prepara el escenario para lo que sigue. Las fibras de colágeno medial se organizan en unidades laminares y se orientan circunferencialmente con pliegues en vasos sanguíneos sanos. Sin embargo, un mayor contenido de colágeno medial puede hacer que la capacidad de dilatación sea más rígida y limitada. Recientemente, las investigaciones han demostrado que la condición de fibrosis preexistente en las venas se asoció con la maduración.

La inflamación para la configuración de FAV se puede dividir en dos partes: inflamación local y sistémica. Para la inflamación local había sido indicada por el traumatismo de creación de fístula e hipoxia local; Para la inflamación sistémica, que ocurre debido a la uremia presente en pacientes con ERC. Un estudio reciente ha sugerido que la falla de la FAV estaba relacionada con la inflamación. La grasa perivascular de la arteria se puede predecir con éxito en la maduración de la FAV. La lipectomía de la vena cefálica es un método de rutina durante la realización de fístulas arteriovenosas en hemodiálisis[9]. Sin embargo, pocos estudios previos han comparado la maduración de la FAV entre la grasa perivascular de la vena cefálica o la extirpación durante la cirugía de la FAV.

Objetivos específicos

La maduración exitosa de la fístula depende de la dilatación y remodelación de la arteria y la vena, pero los vasos rígidos y engrosados ​​de los pacientes con ESRD pueden responder mal a las señales que promueven estas adaptaciones. Aunque nuestros datos preliminares mostraron que la fibrosis vascular preexistente aumentaba en el fracaso de las FAV. Pero el hallazgo aún necesita más verificaciones. En este estudio, los investigadores se centrarán en encontrar marcas moleculares relacionadas con la maduración o el fracaso de las FAV. El estudio incluye las siguientes secciones:

1. Si existe fibrosis vascular en pacientes con FAV y su asociación con fallo de maduración.
2. Si la fibrosis vascular está asociada con la inflamación.
3. Examinar la expresión de citoquinas de neutrófilos en sangre.
4. Si la grasa perivascular de la vena cefálica está asociada con el fracaso de la FAV

Objetivo 1. Si existe fibrosis vascular en pacientes con FAV y su asociación con fallo de maduración. Los investigadores observarán la fibrosis vascular por histopatología y transferencia Western.

En primer lugar, los sujetos son aquellos pacientes urémicos adultos que se someterán a una creación de FAV. La encuesta incluirá a los pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) estadio 5 (ERC-5) y estadio 6 (ERC-6) que necesitarán hemodiálisis (HD) de mantenimiento. Los investigadores utilizarán la herramienta de evaluación de ultrasonido preoperatorio para confirmar la viabilidad de los vasos del brazo para la creación de una FAV nativa.

Como ensayo prospectivo, aleatorizado y controlado de conservación o extracción de grasa perivascular durante la cirugía de FAV, un asistente del estudio ayudará en la aleatorización y explicará el consentimiento informado al paciente. Los sujetos se dividen aleatoriamente en dos grupos: al grupo experimental se le conservará la grasa perivascular de la vena cefálica objetivo y al grupo de control se le extraerá la grasa antes de la anastomosis AVF.

El cirujano recolectará el muñón de la vena distal y 1 cm de grasa subcutánea de al menos 1,5 cm de longitud durante la creación de una FAV, al mismo tiempo obtendrá una muestra de plasma de 10 cc. La encuesta inscribirá a 100 pacientes adultos y los categorizará en grupos según la maduración de cada FAV, JAS o FTM (consulte la definición a continuación) entre 3 y 12 años después de la cirugía.

Valoración ecográfica vascular preoperatoria.

A todos los pacientes se les realizará un examen clínico y ecográfico para evaluar la idoneidad de la cirugía. El paciente será excluido si sus vasos y/o condición clínica no son aptos para hemodiálisis. Una puntuación de madurez de la fístula arteriovenosa de hemodiálisis (HDAVF) basada en las siguientes tres mediciones ultrasónicas objetivas. Dé un rango de puntaje resumido de 0 a 9 puntos. Las puntuaciones más altas indican más madurez. Los parámetros de prueba de ultrasonido se definen de la siguiente manera:

1. Medición del diámetro de la arteria del brazo y el flujo sanguíneo total. La arteria braquial se define como medida desde los 4 (+/- 2,2 a 6) cm proximales dentro de la línea curva del codo. Los investigadores medirán el diámetro vascular y estimarán el flujo sanguíneo total del antebrazo.
2. La exploración de la arteria radial del antebrazo se define como el diámetro de la arteria radial explorada desde el inicio de la línea antecubital hasta la muñeca. Cabe destacar que los investigadores también confirman su diámetro> = 2,0 mm y no identifican estenosis evidente de la línea antecubital a la muñeca. Cabe destacar que los investigadores también confirman su diámetro> = 2,0 mm y no identifican estenosis evidente.
3. Mida el diámetro no aumentado de la vena cefálica. El punto medio se define como el medio entre la línea del codo y la línea de la muñeca, que está alrededor de 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cms distal al codo.
4. Mida el diámetro aumentado de la vena cefálica. Se aplica presión en la parte superior del brazo con un manguito de torniquete a 100 mm-Hg temporalmente y que proporciona una resistencia moderada, se espera 30 segundos y luego los investigadores miden la vena cefálica donde se definió anteriormente. En consecuencia, la definición de distensibilidad venosa se define como el grado de dilatación venosa de la vena cefálica antes y después del aumento. Además, la distensibilidad de la vena se define como el porcentaje de área de sección transversal aumentada/no aumentada de la vena.
5. Los investigadores confirmarán que todo el segmento de la vena cefálica debe tener > 2,0 mm de diámetro y no identificarán estenosis significativa.

Definición de éxito clínico: Se define como la HDAVF diana puede ser utilizada por dos agujas y completar la sesión de HD durante al menos ⅔ de las sesiones de prescripción en un mes. Un criterio mínimo de una carrera es una tasa de flujo sanguíneo promedio de 300 ml/min en una sesión de HD de 3,5 horas para lograr un sp-Kt/V objetivo de 1,2.14 En el que una sesión de HD exitosa se define como la finalización de la HD con un flujo de diálisis superior a 200 ml/min y una duración de la sesión de 4 horas o más.

Definición de éxito por parámetros ecográficos: la encuesta propone un sistema objetivo de puntuación ecográfica y considera una puntuación total de cuatro o más como maduración de la FAV.

Para el análisis histológico, las muestras se incluyeron en parafina y se seccionaron. H&E (hematoxilina y eosina) son tinciones comunes utilizadas en histología. La hematoxilina tiñe los núcleos celulares de color azul, y la eosina tiñe la matriz extracelular y el citoplasma se presenta de color rosa. La tinción con pentacromo de Movat puede demostrar colágeno, elastina, mucina muscular y fibrina en secciones de tejido. Los investigadores utilizan la tinción con rojo Sirius para observar las fibras de colágeno I y III en las secciones de tejido. Para detectar depósitos de calcio, los investigadores utilizan la tinción con rojo Alizan. Para la tinción se utilizará el tricrómico de Masson. En la tinción tricrómica, el músculo liso aparece rojo y el colágeno aparece azul.

Para el ensayo de transferencia Western, la expresión de colágeno, α-SMA, TIMP-1 y TIMP2 aumentará en la fibrosis vascular. Por lo tanto, los investigadores detectarán la expresión de colágeno, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 en tejido de maduración y fallo de AVF. Los tejidos se homogeneizaron y lisaron. La concentración de proteína para cada extracto de tejido se determinó utilizando un ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, EE. UU.). Cincuenta microgramos de proteína de lisados ​​de tejido por carril se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, EE. UU.). Las membranas se bloquearon en leche en polvo desgrasada al 5 %/PBS/Tween-20 al 0,1 % (PBST) y luego se incubaron con el anticuerpo primario durante 1 hora. Las transferencias se lavaron 4 veces con PBST y se añadió el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pensilvania, EE. UU.) (1:10.000) durante otra hora. Finalmente, las membranas se lavaron en PBST y la detección del antígeno se realizó mediante el método de detección de quimioluminiscencia mejorada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Objetivo 2. Si la fibrosis vascular se asocia con inflamación. La inflamación en el contexto de la FAV estuvo involucrada local y sistémicamente. Inflamación local causada por traumatismo de creación de fístula e hipoxia local. Por lo tanto, los investigadores medirán IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5 (RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 y compararán la expresión entre la maduración de AVF y el tejido fallido mediante QPCR y Multiplex ELISA. Además, la inflamación sistémica ocurre debido a la uremia que está presente en las enfermedades renales crónicas. Además, los investigadores detectarán la expresión de IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5 (RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 y compararán la expresión entre la maduración de AVF y el suero fallido mediante el ensayo CBA.

Para el ensayo QPCR, el ARN se extrajo del tejido de la vena mediante el protocolo TRIzol (Life Technologies, Invitrogen). Las concentraciones de ARN se cuantificaron mediante Nanodrop. La pureza del ARN total extraído se determinó como la relación de 260/280 nm y se comprobó la integridad. QPCR fue realizado por el sistema TaqMan.

Para el ensayo ELISA, los tejidos se lisaron en tampón PBS y se usaron kits ELISA comerciales (R&D) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los lisados ​​se normalizaron al contenido de proteína total determinado usando un kit de ensayo de proteína BCA comercial.

Para el ensayo Cytokine Bead Array (CBA), se utilizó el kit CBA de citocinas inflamatorias humanas (BD Biosciences, San Jose, CA), que mide todas las citocinas anteriores excepto GM-CSF, IL-2 e IFN-γ; los datos se adquirieron en un citómetro de flujo calibre BDTM FACS. Ambos ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante excepto por el uso de curvas de calibración modificadas como se describe a continuación. Todos los patrones y muestras se midieron por duplicado.

Objetivo 3. Examinar el perfil de expresión de citocinas de neutrófilos en sangre. Para realizar esto, los investigadores examinarán la población de neutrófilos de sangre periférica mediante tinción de citometría de flujo con CD11b+/CD66b/CD34/CD45. A continuación, determinar el porcentaje de neutrófilos que expresan citocinas diana en sangre periférica.