Marcador inflamatório e fibrose venosa pré-existente para prever má maturação da FAV

A fístula arteriovenosa (FAV) é o acesso vascular preferencial para hemodiálise, que é criada cirurgicamente, mas conectando uma veia superficial à artéria próxima e permitindo que esta veia se expanda e aumente de diâmetro interno sob circulação arterial. A maturação bem-sucedida da fístula depende da dilatação e remodelação da artéria e da veia, mas os vasos rígidos e espessados ​​dos pacientes com doença renal terminal (DRT) podem responder mal aos sinais que promovem essas adaptações. Cerca de 20 a 40% das FAVs falham na maturação e nenhum tratamento eficaz para prevenir a falha na maturação das FAVs. Paulson WD resumiu quatro pontos para falha de maturação. Habilidade cirúrgica; doença vascular preexistente; Eventos ascendentes; e eventos downstream. Os eventos upstream são os mecanismos que inicialmente causam lesão ao endotélio (trauma cirúrgico, estresse de cisalhamento hemodinâmico, lesão da parede do vaso causada por punções de agulha, etc.). Os eventos a jusante são as respostas à lesão endotelial (adesão de leucócitos, migração de células musculares lisas da camada média para a íntima, proliferação de músculo liso, etc.). No entanto, os eventos a montante e a jusante são etapas importantes na falha de maturação, a doença vascular preexistente não deve ser negligenciada, pois prepara o terreno para o que se segue. As fibras de colágeno medial são organizadas em unidades lamelares e orientadas circunferencialmente com ondulações em vasos sanguíneos saudáveis. No entanto, maior conteúdo de colágeno medial pode ser mais rígido e capacidade limitada de dilatar. Recentemente, pesquisas mostraram que a condição de fibrose preexistente nas veias estava associada à maturação.

A inflamação para definição de FAV pode ser dividida em duas partes: inflamação local e sistêmica. Para inflamação local havia sido indicada causada pelo trauma da criação da fístula e hipóxia local; Para inflamação sistêmica, que ocorre devido à uremia presente em pacientes com DRC. Estudos recentes sugeriram que a falha da FAV estava ligada à inflamação. A gordura perivascular da artéria pode prever a maturação bem-sucedida da FAV. A lipectomia da veia cefálica é um método de rotina durante a criação de fístula arteriovenosa em hemodiálise [9]. No entanto, poucos estudos anteriores compararam a maturação da FAV entre a gordura perivascular da veia cefálica ou a remoção durante a cirurgia da FAV.

Objetivos específicos

A maturação bem-sucedida da fístula depende da dilatação e remodelação da artéria e da veia, mas os vasos rígidos e espessados ​​dos pacientes com insuficiência renal terminal podem responder mal aos sinais que promovem essas adaptações. Embora nossos dados preliminares mostrem que a fibrose vascular preexistente aumentou na falência das FAVs. Mas a descoberta ainda precisa de mais verificações. Neste estudo, os investigadores se concentrarão na descoberta de marcas moleculares relacionadas à maturação ou falha das FAVs. O estudo inclui as seguintes seções:

1. Se existe fibrose vascular em pacientes com FAV e sua associação com falha de maturação.
2. Se a fibrose vascular está associada à inflamação.
3. Examine a expressão de citocinas de neutrófilos no sangue.
4. Se a gordura perivascular da veia cefálica está associada à insuficiência AVF

Objetivo 1. Se existe fibrose vascular em pacientes com FAV e sua associação com falha de maturação. Os investigadores observarão a fibrose vascular por histopatologia e western blot.

Em primeiro lugar, os sujeitos são aqueles pacientes urêmicos adultos que serão submetidos à confecção de FAV. A pesquisa incluirá pacientes com doença renal crônica (DRC) estágio 5 (DRC-5) e estágio 6 (DRC-6) que precisarão de hemodiálise (HD) de manutenção. Os investigadores usarão a ferramenta de avaliação ultrassonográfica pré-operatória para confirmar a viabilidade dos vasos do braço para a criação de uma FAV nativa.

Como um estudo controlado randomizado prospectivo de preservação ou remoção de gordura perivascular durante a cirurgia de FAV, um assistente do estudo ajudará na randomização e explicará o consentimento informado ao paciente. Os sujeitos são divididos aleatoriamente em dois grupos: o grupo experimental terá a gordura perivascular da veia cefálica alvo preservada e o grupo controle terá a gordura retirada antes da anastomose da FAV.

O cirurgião colherá o coto da veia distal e 1 cm de gordura subcutânea por pelo menos 1,5 cm de comprimento durante a criação de uma FAV, ao mesmo tempo em que obterá uma amostra de plasma de 10 cc. A pesquisa vai inscrever 100 pacientes adultos e categorizá-los em grupos de acordo com cada maturação AVF, JAS ou FTM (ver definição abaixo) por 3 a 12 após a cirurgia.

Avaliação ultrassonográfica vascular pré-operatória.

Todos os pacientes terão exame clínico e ultrassonográfico para avaliar a adequação da cirurgia. O paciente será excluído caso seus vasos e/ou condição clínica não sejam adequados para hemodiálise. Uma pontuação de maturidade da fístula arteriovenosa para hemodiálise (HDAVF) com base nas três medições ultrassônicas objetivas a seguir. Dê uma pontuação resumida de 0 a 9 pontos. Pontuações mais altas indicam mais maturidade. Os parâmetros de teste de ultrassom são definidos da seguinte forma:

1. Medindo o diâmetro da artéria do braço e o fluxo sanguíneo total. A artéria braquial é definida como medida a partir dos 4 (+/- 2,2 a 6) cm proximais dentro da linha curva do cotovelo. Os investigadores medirão o diâmetro vascular e estimarão o fluxo sanguíneo total do antebraço.
2. A varredura da artéria radial do antebraço é definida como o diâmetro da artéria radial escaneada desde o início da antecubital até a linha do punho. Notavelmente, os investigadores também confirmam seu diâmetro > = 2,0 mm e não identificam nenhuma estenose óbvia da antecubital à linha do pulso. Notavelmente, os investigadores também confirmam seu diâmetro > = 2,0 mm e não identificam nenhuma estenose óbvia.
3. Meça o diâmetro não aumentado da veia cefálica. O ponto médio dele é definido como o meio entre a linha do cotovelo e a linha do pulso, que é cerca de 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distal ao cotovelo.
4. Meça o diâmetro aumentado da veia cefálica. Pressão é aplicada no braço com manguito de torniquete a 100 mm Hg temporariamente e que fornece resistência moderada, aguarde 30 segundos e, em seguida, os investigadores medem a veia cefálica onde foi definido acima. Assim, a definição de complacência venosa é definida como o grau de dilatação venosa da veia cefálica antes e depois do aumento. Além disso, a complacência da veia é definida como a porcentagem de área de seção transversal aumentada/não aumentada da veia.
5. Os investigadores confirmarão que todo o segmento da veia cefálica deve ter diâmetro > 2,0 mm e não identificarão estenose significativa.

Definição de sucesso clínico: É definido como o alvo HDAVF pode ser usado por duas agulhas e completar a sessão de HD por pelo menos ⅔ das sessões de prescrição em um mês. Um critério mínimo de corrida é uma taxa média de fluxo sanguíneo de 300 ml/min em uma sessão de HD de 3,5 horas para atingir um sp-Kt/V alvo de 1,2,14 Em que uma sessão de HD bem-sucedida é definida como a conclusão da HD com uma taxa de fluxo de diálise superior a 200 ml/min e uma duração de sessão de 4 horas ou mais.

Definição de sucesso por parâmetros ultrassonográficos: a pesquisa propõe um sistema objetivo de pontuação ultrassonográfica e considera uma pontuação total de quatro ou mais como maturação da FAV.

Para análise histológica, as amostras foram embebidas em parafina e seccionadas. H&E (hematoxilina e eosina) são corantes comuns usados ​​em histologia. A hematoxilina cora os núcleos das células em azul, e a eosina cora a matriz extracelular e o citoplasma apresenta-se em rosa. A coloração Movat pentachrome pode demonstrar que colágeno, elastina, mucina muscular e fibrina em seções de tecido. Os investigadores usam a coloração Sirius-red para observar as fibras de colágeno I e III em seções de tecido. Para detectar depósitos de cálcio, os investigadores usam a coloração vermelha de Alizan. O tricrômico de Masson será usado para manchar. Na coloração tricrômica, o músculo liso aparece em vermelho e o colágeno em azul.

Para o ensaio de western blot, a expressão de colágeno, α-SMA, TIMP-1 e TIMP2 aumentará na fibrose vascular. Portanto, os investigadores detectarão a expressão de colágeno, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 na maturação e falência da FAV. Os tecidos foram homogeneizados e lisados. A concentração de proteína para cada extrato de tecido foi determinada usando um ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fornecedor (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, EUA). Cinquenta microgramas de proteínas de lisados ​​de tecido por pista foram separados por SDS-PAGE sob condições redutoras e transferidos para membranas de PVDF (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, EUA). As membranas foram bloqueadas em leite em pó desengordurado 5%/PBS/0,1% Tween-20 (PBST) e então incubadas com o anticorpo primário por 1 hora. Os blots foram lavados 4 vezes com PBST e o anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pensilvânia, EUA) foi adicionado (1:10.000) por mais uma hora. Por fim, as membranas foram lavadas em PBST e a detecção do antígeno foi realizada usando o método de detecção por quimioluminescência aprimorada de acordo com as recomendações do fabricante

Objetivo 2. Se a fibrose vascular está associada à inflamação. A inflamação no contexto da FAV estava envolvida local e sistemicamente. Inflamação local causada por trauma de criação de fístula e hipóxia local. Assim, os investigadores medirão IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 e compararão a expressão entre a maturação da AVF e falha tecidual por QPCR e Multiplex ELISA. Além disso, a inflamação sistêmica ocorre devido à uremia presente nas doenças renais crônicas. Além disso, os investigadores irão detectar a expressão de IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 e comparar a expressão entre a maturação de AVF e soro de falha por ensaio CBA.

Para o ensaio QPCR, o RNA foi extraído do tecido da veia pelo protocolo TRIzol (Life Technologies, Invitrogen). As concentrações de RNA foram quantificadas por Nanodrop. A pureza do RNA total extraído foi determinada como a razão 260/280 nm e a integridade foi verificada. A QPCR foi realizada pelo sistema TaqMan.

Para o ensaio ELISA, os tecidos foram lisados ​​em tampão PBS e usando kits ELISA comerciais (R&D) de acordo com o protocolo do fabricante. Os lisados ​​foram normalizados para o teor de proteína total determinado usando um kit de ensaio de proteína BCA comercial.

Para o ensaio Cytokine Bead Array (CBA), foi utilizado o kit Human Inflammatory Cytokines CBA (BD Biosciences, San Jose, CA), que mede todas as citocinas acima, exceto GM-CSF, IL-2 e IFN-γ; os dados foram adquiridos em um citômetro de fluxo de calibre BDTM FACS. Ambos os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante, exceto pelo uso de curvas de calibração modificadas conforme descrito abaixo. Todos os padrões e amostras foram medidos em duplicata.

Objetivo 3. Examinar o perfil de expressão de citocinas de neutrofílicos no sangue. Para realizar isso, os investigadores examinarão a população de neutrófilos do sangue periférico por citometria de fluxo com CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Em seguida, determine a porcentagem de neutrófilos que expressam citocinas alvo no sangue periférico.