Gyulladásos marker és már meglévő vénás fibrózis az AVF mal-érés előrejelzésére

Az arteriovenosus fistula (AVF) a hemodialízis előnyben részesített érrendszere, amelyet sebészi úton hoznak létre, de egy felületes vénát kötnek össze a közeli artériával, és lehetővé teszik ennek a vénának a megnagyobbodását és belső átmérőjének növekedését az artériás keringés alatt. A fisztula sikeres érése az artéria és a véna tágulásától és átépülésétől függ, de a végstádiumú vesebetegségben (ESRD) szenvedő betegek merev és megvastagodott erei rosszul reagálhatnak az ezeket az alkalmazkodást elősegítő jelekre. Az AVF érésének körülbelül 20-40%-a sikertelen, és nincs hatékony kezelés az AVF érési kudarc megelőzésére. Paulson WD négy pontot összegzett az érési kudarcért. Sebészi készség; már meglévő érbetegség; Upstream események; és Downstream események. Az upstream események azok a mechanizmusok, amelyek kezdetben az endotélium sérülését okozzák (sebészeti trauma, hemodinamikai nyírófeszültség, tűszúrások okozta érfalsérülés stb.). A downstream események az endoteliális sérülésekre adott válaszok (leukociták adhézió, simaizomsejtek migrációja a tápközegből az intimrétegbe, simaizom-proliferáció stb.). Mindazonáltal az upstream és downstream események fontos lépései az érési kudarcnak, a már meglévő érbetegséget nem szabad figyelmen kívül hagyni, mivel ez megalapozza a következőket. A mediális kollagénrostok lamelláris egységekre szerveződnek, és az egészséges erekben a kerület mentén, hullámosodással orientálódnak. A magasabb mediális kollagéntartalom azonban merevebb lehet, és korlátozott a tágulási képessége. A közelmúltban végzett kutatások kimutatták, hogy a vénákban már meglévő fibrózisos állapot az éréssel társult.

Az AVF beállításához szükséges gyulladás két részre osztható: helyi és szisztémás gyulladásra. Lokális gyulladást jeleztek a sipolyképződés traumája és lokális hipoxia; Szisztémás gyulladásra, amely a krónikus vesebetegségben szenvedő betegekben előforduló urémia miatt következik be. A közelmúltban végzett tanulmányok azt sugallták, hogy az AVF kudarca összefügg a gyulladással. Az artériák perivaszkuláris zsírszövetének sikeres AVF érése megjósolható. A fejvéna lipectomiája rutin módszer a hemodialízis során az arteriovenosus fisztula létrehozása során[9]. Azonban néhány korábbi tanulmány összehasonlította az AVF érését a fejvéna perivaszkuláris zsírja vagy az AVF műtét során történő eltávolítása között.

Konkrét célok

A fisztula sikeres érése az artéria és a véna tágulásától és átépülésétől függ, de az ESRD-betegek merev és megvastagodott erei rosszul reagálhatnak az ezeket az adaptációkat elősegítő jelekre. Bár előzetes adataink azt mutatták, hogy a már meglévő vaszkuláris fibrózis nőtt az AVF kudarcában. A lelet azonban további ellenőrzéseket igényel. Ebben a tanulmányban a kutatók az AVF-ek érésével vagy meghibásodásával kapcsolatos molekuláris jelek megtalálására összpontosítanak. A tanulmány a következő részeket tartalmazza:

1. Létezik-e vaszkuláris fibrózis AVF-betegekben, és ez összefüggésben van-e az érési elégtelenséggel.
2. A vaszkuláris fibrózis gyulladással jár-e.
3. Vizsgálja meg a neutrofil citokinek expresszióját a vérben.
4. A fejvénák perivaszkuláris zsírtartalma összefüggésben áll-e az AVF-elégtelenséggel

Célkitűzés 1. Létezik-e vaszkuláris fibrózis AVF-betegekben, és ennek összefüggése az érési elégtelenséggel? A kutatók a vaszkuláris fibrózist hisztopatológiai és Western-blot módszerrel fogják megfigyelni.

Először is, az alanyok azok a felnőtt urémiás betegek, akiknek AVF létrehozása lesz. A felmérésbe azokat a krónikus vesebetegségben (CKD) 5. stádiumú (CKD-5) és 6. stádiumú (CKD-6) betegeket vonják be, akiknek fenntartó hemodialízisre (HD) lesz szükségük. A nyomozók a műtét előtti ultrahang értékelő eszközt fogják használni, hogy megerősítsék a kar ereinek megvalósíthatóságát egy natív AVF létrehozására.

Az AVF műtét során a perivaszkuláris zsír megőrzésének vagy eltávolításának prospektív randomizált, kontrollált vizsgálataként egy tanulmányi asszisztens segíti a randomizálást, és elmagyarázza a betegnek a tájékozott beleegyezését. Az alanyokat véletlenszerűen két csoportra osztjuk: a kísérleti csoportban megőrizzük a cél fejvéna perivascularis zsírját, a kontroll csoporttól eltávolítjuk a zsírt az AVF anasztomózis előtt.

A sebész az AVF létrehozása során a distalis vénás csonkot és 1 cm szubkután zsírt gyűjti le legalább 1,5 cm hosszúságban, egyúttal 10 cm3-es plazmamintát is kap. A felmérésbe 100 felnőtt beteget vonnak be, és csoportokba sorolják őket az egyes AVF-érések, JAS-ok vagy FTM-ek szerint (lásd lent a definíciót) a műtét után 3-12 óráig.

Preoperatív vaszkuláris ultrahang vizsgálat.

Minden betegnek klinikai és ultrahangos vizsgálaton kell részt vennie a műtét alkalmasságának megítélésére. A beteg kizárásra kerül, ha erei és/vagy klinikai állapota nem alkalmas hemodialízisre. A hemodialízis arteriovenosus fistula (HDAVF) érettségi pontszáma a következő három objektív ultrahangos mérés alapján. Adja meg a 0 és 9 pont közötti összefoglaló pontszámot. A magasabb pontszámok érettebbre utalnak. Az ultrahangvizsgálat paraméterei a következők:

1. A kar artéria átmérőjének és a teljes véráramlás mérése. A brachialis artériát a könyök ívelt vonalán belüli proximális 4 (+/- 2,2-6) cm-től mérve határozzák meg. A vizsgálók megmérik az érátmérőt és megbecsülik az alkar teljes véráramlását.
2. Az alkar radiális artériás letapogatása a sugárirányú artéria átmérője, amely az antecubitalis kezdetétől a csuklóig terjed. Megjegyzendő, hogy a kutatók azt is megerősítik, hogy az átmérő > = 2,0 mm, és nem azonosítják az antecubitalis nyilvánvaló szűkületét a csuklóvonalhoz képest. Megjegyzendő, hogy a kutatók azt is megerősítik, hogy az átmérő > = 2,0 mm, és nem azonosítanak nyilvánvaló szűkületet.
3. Mérje meg a fejvéna nem kiterjesztett átmérőjét. Felezőpontja a könyökvonal és a csuklóvonal közötti középpont, amely körülbelül 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm-rel távolabb van a könyöktől.
4. Mérje meg a fejvéna megnövelt átmérőjét. Ideiglenesen 100 Hgmm nyomást gyakorolunk a felkarra érszorítós mandzsettával, amely mérsékelt ellenállást biztosít, várjon 30 másodpercet, majd a vizsgálók megmérik a fejvénát a fent meghatározott helyen. Ennek megfelelően a vénás compliance definíciója a fejvéna vénás tágulásának mértéke az augmentáció előtt és után. Továbbá, a véna megfelelőségét a véna megnövelt/nem kiterjesztett keresztmetszeti területének százalékos arányaként határozzuk meg.
5. A kutatók megerősítik, hogy a fejvéna teljes szegmense átmérője > 2,0 mm, és nem azonosítanak jelentős szűkületet.

A klinikai siker definíciója: Úgy definiálják, hogy a HDAVF célértéke két tűvel használható, és egy hónapon belül legalább ⅔ felírási cikluson keresztül teljesíthető a HD kezelés. A futás minimális kritériuma 300 ml/perc átlagos véráramlási sebesség egy 3,5 órás HD munkamenetben az 1,2,14 sp-Kt/V célérték eléréséhez. Abban az esetben, ha sikeres HD-munkamenetet definiálnak, ha a HD-t a dialízis áramlási sebessége meghaladja a 200 ml/perc-nél, és az ülés időtartama legalább 4 óra.

A siker meghatározása ultrahang-paraméterekkel: a felmérés objektív ultrahang-pontozási rendszert javasol, és a négyes vagy annál nagyobb összpontszámot tekinti AVF-érésnek.

A szövettani analízishez a mintákat paraffinba ágyaztuk, és metszettek. A H&E (hematoxilin és eozin) a szövettanban gyakran használt foltok. A hematoxilin megfesti a sejtmagokat kék színű, az eozin megfesti az extracelluláris mátrixot, és a citoplazma rózsaszínű. A Movat pentakróm festéssel kimutatható, hogy a kollagén, elasztin, izommucin és fibrin a szövetmetszetekben. A kutatók Sirius-vörös festést használnak a kollagén I és III rostok megfigyelésére a szövetmetszetekben. A kalcium lerakódások kimutatására a nyomozók Alizan vörös festést alkalmaznak. A Masson trikrómját fogják használni a festéshez. A trikróm foltban a simaizom vörösnek, a kollagén pedig kéknek tűnik.

A Western blot vizsgálathoz a kollagén, az α-SMA, a TIMP-1 és a TIMP2 expressziója fokozódik az érfibrózisban. Ezért a kutatók kimutatni fogják a kollagén, az α-SMA, az MMP-9, az MMP2, a TIMP-1, a TIMP2 expresszióját az AVF érésében és a károsodásban lévő szövetekben. A szöveteket homogenizáltuk és lizáltuk. Minden egyes szövetkivonat fehérjekoncentrációját BCA fehérjevizsgálattal határoztuk meg a szállító (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) utasításai szerint. 50 mikrogramm szöveti lizátum fehérjét sávonként SDS-PAGE-val választottunk el redukáló körülmények között, és PVDF membránokra blottoltuk (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). A membránokat 5% zsírtalanított száraz tej/PBS/0,1% Tween-20 (PBST) elegyben blokkoltuk, majd az elsődleges antitesttel 1 órán át inkubáltuk. A blotokat négyszer PBST-vel mostuk, és a másodlagos peroxidázzal konjugált antitestet (Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) adtuk hozzá további órára (1:10 000). Végül a membránokat PBST-ben mostuk, és az antigén kimutatását a fokozott kemilumineszcenciás detektálási módszerrel végeztük a gyártó ajánlásai szerint.

2. cél. A vaszkuláris fibrózis összefügg-e gyulladással? Az AVF hátterében fellépő gyulladás lokálisan és szisztémásan is érintett volt. Lokális gyulladás, amelyet a sipolyképződés traumája és helyi hipoxia okoz. Tehát a kutatók meg fogják mérni az IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 értékeket, és összehasonlítják az AVF-érés és a hibás szövet közötti expressziót QPCR és Multiplex ELISA segítségével. Emellett szisztémás gyulladás lép fel a krónikus vesebetegségekben előforduló urémia miatt. Ezenkívül a kutatók kimutatni fogják az IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 expresszióját, és összehasonlítják az AVF-érés és a szérum károsodása közötti expressziót CBA-vizsgálattal.

A QPCR vizsgálathoz az RNS-t a vénaszövetből extraháltuk a TRIzol protokoll szerint (Life Technologies, Invitrogen). Az RNS-koncentrációt Nanodrop segítségével határoztuk meg. Az extrahált teljes RNS tisztaságát 260/280 nm arányban határoztuk meg, és ellenőriztük az integritást. A QPCR-t a TaqMan rendszerrel végeztük.

Az ELISA vizsgálathoz a szöveteket PBS pufferben lizáltuk, és kereskedelmi ELISA készleteket (R&D) használtunk a gyártó protokollja szerint. A lizátumokat a teljes fehérjetartalomra normalizáltuk, amelyet egy kereskedelmi forgalomban lévő BCA fehérje vizsgálati kittel határoztunk meg.

A Cytokin Bead Array (CBA) vizsgálathoz a Human Inflammatory Cytokines CBA Kit-et (BD Biosciences, San Jose, CA) használtuk, amely a GM-CSF, IL-2 és IFN-y kivételével az összes fenti citokint méri; Az adatokat BDTM FACS kaliberű áramlási citométerrel gyűjtöttük. Mindkét vizsgálatot a gyártó utasításai szerint hajtottuk végre, kivéve az alábbiakban leírt módosított kalibrációs görbék alkalmazását. Minden standardot és mintát két párhuzamosban mértünk.

Cél 3. Vizsgálja meg a neutrofil citokinek expressziós profilját a vérben. Ennek elvégzéséhez a vizsgálók megvizsgálják a perifériás vér neutrofil populációját áramlási citometriás festéssel CD11b+/CD66b/CD34/CD45-tel. Ezután meghatározzuk a perifériás vérben a célcitokineket expresszáló neutrofilek százalékos arányát.