Inflammatorisk markör och redan existerande venös fibros för att förutsäga AVF-mal-mognad

Den arteriovenösa fisteln (AVF) är den föredragna vaskulära åtkomsten för hemodialys, som skapas kirurgiskt men förbinder en ytlig ven till närliggande artär och tillåter denna ven att förstoras och öka i inre diameter under arteriell cirkulation. Framgångsrik fistelmognad beror på dilatation och ombyggnad av artären och venen, men de stela och förtjockade kärlen hos patienter med slutstadiet med njursjukdomar (ESRD) kan svara dåligt på signaler som främjar dessa anpassningar. Cirka 20 - 40 % av AVFs mognad misslyckas och ingen effektiv behandling för att förhindra AVF-mognadssvikt. Paulson WD sammanfattade fyra poäng för mognadsfel. Kirurgisk skicklighet; redan existerande vaskulär sjukdom; Uppströms evenemang; och Downstream-evenemang. Uppströmshändelser är de mekanismer som initialt orsakar skada på endotelet (kirurgiskt trauma, hemodynamisk skjuvspänning, kärlväggsskada orsakad av nålpunkteringar, etc.). Nedströmshändelser är svaren på endotelskada (leukocytadhesion, migrering av glatta muskelceller från media till intima skiktet, proliferation av glatt muskel, etc.). Men uppströms och nedströms händelser är viktiga steg i mognadssvikt, redan existerande kärlsjukdom bör inte försummas eftersom det sätter scenen för vad som följer. Mediala kollagenfibrer är organiserade i lamellära enheter och orienterade periferiellt med krusningar i friska blodkärl. Men högre medialt kollageninnehåll kan vara styvare och begränsad förmåga att dilatera. Nyligen har forskning visat att redan existerande fibrostillstånd i vener var associerat med mognad.

Inflammation för AVF-inställning kan delas in i två delar: lokal och systemisk inflammation. För lokal inflammation hade indikerats orsakad av trauma av fistelskapande och lokal hypoxi; För systemisk inflammation, som uppstår på grund av uremi hos CKD-patienter. Ny studie har föreslagit AVF-fel var kopplat till inflammation. Det perivaskulära fettet i artären kan förutsägas framgångsrik AVF-mognad. Lipektomi av huvudvenen är en rutinmetod under hemodialysbildning av arteriovenös fistel[9]. Emellertid har få tidigare studier jämfört AVF-mognad mellan perivaskulär fett från cephalic ven eller avlägsnande under AVF-operationen.

Specifika mål

Framgångsrik fistelmognad beror på dilatation och ombyggnad av artären och venen, men de stela och förtjockade kärlen hos ESRD-patienter kan svara dåligt på signaler som främjar dessa anpassningar. Även om våra preliminära data visade att redan existerande vaskulär fibros ökade i AVF-fel. Men fyndet behöver fortfarande fler verifieringar. I denna studie kommer utredarna att fokusera på upptäckten av molekylära märken som är relaterade till AVFs mognad eller misslyckande. Studien inkluderar följande avsnitt:

1. Huruvida vaskulär fibros existerar hos AVF-patienter och dess samband med mognadssvikt.
2. Huruvida vaskulär fibros är associerad med inflammation.
3. Undersök cytokinuttrycket av neutrofiler i blod.
4. Huruvida det perivaskulära fettet i cephalisk ven är associerat med AVF-fel

Syfte 1. Huruvida vaskulär fibros förekommer hos AVF-patienter och dess samband med mognadssvikt. Utredarna kommer att observera vaskulär fibros genom histopatologi och western blot.

Först och främst är försökspersonerna de vuxna uremiska patienter som kommer att genomgå en AVF-skapelse. Undersökningen kommer att registrera patienter med kronisk njursjukdom (CKD) stadium 5 (CKD-5) och stadium 6 (CKD-6) som kommer att behöva underhållshemodialys (HD). Utredarna kommer att använda det preoperativa ultraljudsbedömningsverktyget för att bekräfta genomförbarheten av armkärlen för att skapa en inbyggd AVF.

Som en prospektiv randomiserad kontrollerad studie av perivaskulärt fettbevarande eller avlägsnande under AVF-operationen, kommer en studieassistent att hjälpa till med randomiseringen och förklara det informerade samtycket för patienten. Försökspersonerna är slumpmässigt uppdelade i två grupper: experimentgruppen kommer att ha det perivaskulära fettet från den cefaliska målvenen bevarat, kontrollgruppen kommer att få fettet borttaget före AVF-anastomosen.

Kirurgen kommer att skörda den distala venstumpen och 1 cm subkutant fett i minst 1,5 cm i längd under en AVF-skapande, samtidigt som han får ett 10-cc plasmaprov. Undersökningen kommer att registrera 100 vuxna patienter och kategorisera dem i grupper enligt varje AVF-mognad, JAS eller FTM (se definition nedan) 3-12 efter operationen.

Preoperativ vaskulär ultraljudsbedömning.

Alla patienter kommer att genomgå klinisk undersökning och ultraljudsundersökning för att bedöma lämpligheten av operation. Patienten kommer att uteslutas om deras kärl och/eller kliniska tillstånd inte är lämpliga för hemodialys. Ett mognadspoäng för hemodialys arteriovenös fistel (HDAVF) baserat på följande tre objektiva ultraljudsmätningar. Ge ett sammanfattande poängintervall från 0 till 9 poäng. Högre poäng indikerar mer mogen. Parametrar för ultraljudstest definieras enligt följande:

1. Mätning av armartärens diameter och totalt blodflöde. Brachialisartären definieras som mätt från de proximala 4 (+/- 2,2 till 6) cm inom den krökta linjen i armbågen. Utredarna kommer att mäta den vaskulära diametern och uppskatta det totala blodflödet i underarmen.
2. Radiell artärskanning av underarmen definieras som diametern på den radiella artären skannad från början av antecubital till handledslinjen. Det bör noteras att utredarna också bekräftar dess diameter > = 2,0 mm och identifierar ingen uppenbar stenos av antecubital till handleden. Notera att utredarna också bekräftar dess diameter > = 2,0 mm och identifierar ingen uppenbar stenos.
3. Mät den icke-förstorade diametern av den cefaliska venen. Mittpunkten av den definieras som mitten mellan armbågslinjen och handledslinjen, vilket är cirka 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distalt från armbågen.
4. Mät den förstärkta diametern av den cefaliska venen. Tryck appliceras på överarmen med tourniquet-manschett till 100 mm-Hg tillfälligt och som ger måttligt motstånd, vänta 30 sekunder, sedan mäter utredarna huvudvenen där den har definierats ovan. Följaktligen definieras definitionen av venös följsamhet som graden av venös dilatation av huvudvenen före och efter augmentation. Dessutom definieras venens följsamhet som procentandelen av förstärkt/icke-förstorat tvärsnittsarea av venen.
5. Utredarna kommer att bekräfta att hela segmentet av huvudvenen ska vara > 2,0 mm i diameter och identifiera ingen signifikant stenos.

Definition av klinisk framgång: Det definieras som att målet HDAVF kan användas av två nålar och slutföra HD-sessionen under minst ⅔ av förskrivningssessioner på en månad. Ett minimikriterium för en körning är en genomsnittlig blodflödeshastighet på 300 ml/min i en 3,5-timmars HD-session för att uppnå ett mål sp-Kt/V på 1.2.14 Där en framgångsrik HD-session definieras som fullbordande av HD med en dialysflödeshastighet är mer än 200 ml/min och en sessionslängd på 4 timmar eller mer.

Definition av framgång genom ultraljudsparametrar: undersökningen föreslår ett objektivt ultraljudspoängsystem och betraktar en totalpoäng på fyra eller mer som AVF-mognad.

För histologisk analys paraffininbäddades prover och snittades. H&E (hematoxylin och eosin) är vanliga fläckar som används inom histologi. De hematoxylinfärgade cellkärnorna är blå och eosinfärgar den extracellulära matrisen och cytoplasman är rosa. Movat pentakromfärgning kan påvisas att kollagen, elastin, muskelmucin och fibrin i vävnadssnitt. Utredarna använder Sirius-röd färgning för att observera kollagen I- och III-fibrerna i vävnadssnitt. För att upptäcka kalciumavlagringar använder utredarna Alizan röd färgning. Massons trikrom kommer att användas för att färga. I trikromfärgningen ser glatt muskulatur röd ut och kollagen verkar blått.

För western blot-analys kommer uttryck av kollagen, α-SMA, TIMP-1 och TIMP2 att öka vid vaskulär fibros. Därför kommer utredarna att detektera uttryck av kollagen, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 i AVF-mognads- och felvävnad. Vävnader homogeniserades och lyserades. Proteinkoncentrationen för varje vävnadsextrakt bestämdes med användning av en BCA-proteinanalys enligt instruktionerna från leverantören (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Femtio mikrogram vävnadslysatprotein per bana separerades med SDS-PAGE under reducerande betingelser och blottades på PVDF-membran (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Membran blockerades i 5 % avfettad torrmjölk/PBS/0,1 % Tween-20 (PBST) och inkuberades sedan med den primära antikroppen under 1 timme. Blottar tvättades 4 gånger PBST och den sekundära peroxidaskonjugerade antikroppen (Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) tillsattes (1:10 000) under ytterligare en timme. Slutligen tvättades membranen i PBST, och detektion av antigenet utfördes med den förbättrade kemiluminescensdetektionsmetoden enligt tillverkarens rekommendationer

Syfte 2. Huruvida vaskulär fibros är associerad med inflammation. Inflammation i AVF-miljön var inblandad lokalt och systemiskt. Lokal inflammation orsakad av trauma av fistelskapande och lokal hypoxi. Så, utredarna kommer att mäta IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 och jämföra uttryck mellan AVF-mognad och felvävnad med QPCR och Multiplex ELISA. Dessutom uppstår systemisk inflammation på grund av uremi som finns vid kroniska njursjukdomar. Utredarna kommer också att detektera uttryck av IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 och jämföra uttryck mellan AVF-mognad och felserum med CBA-analys.

För QPCR-analys extraherades RNA från venvävnad med TRIzol-protokollet (Life Technologies, Invitrogen). RNA-koncentrationer kvantifierades med Nanodrop. Renheten hos det totala RNA som extraherades bestämdes som förhållandet 260/280 nm och integriteten kontrollerades. QPCR utfördes av TaqMan-systemet.

För ELISA-analys lyserades vävnader i PBS-buffert och med användning av kommersiella ELISA-kit (R&D) enligt tillverkarens protokoll. Lysaten normaliserades till den totala proteinhalten bestämd med användning av ett kommersiellt BCA-proteinanalyskit.

För Cytokine Bead Array (CBA) analys användes Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA), som mäter alla ovanstående cytokiner förutom GM-CSF, IL-2 och IFN-y; data erhölls på en BDTM FACS-kaliberflödescytometer. Båda analyserna utfördes enligt tillverkarens instruktioner förutom användningen av modifierade kalibreringskurvor som beskrivs nedan. Alla standarder och prover mättes i duplikat.

Syfte 3. Undersök cytokinexpressionsprofilen för neutrofila i blod. För att utföra detta kommer utredarna att undersöka den perifera neutrofilpopulationen i blodet genom flödescytometrifärgning med CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Nästa för att bestämma procentandelen neutrofiler som uttrycker målcytokiner i perifert blod.