Inflammatorisk markør og eksisterende venøs fibrose for å forutsi AVF-mal-modning

Den arteriovenøse fistelen (AVF) er den foretrukne vaskulære tilgangen for hemodialyse, som er kirurgisk opprettet, men kobler en overfladisk vene til nærliggende arterie og lar denne venen forstørre og øke i indre diameter under arteriell sirkulasjon. Vellykket fistelmodning avhenger av dilatasjon og ombygging av arterien og venen, men de stive og fortykkede karene til pasienter med nyresykdom i sluttstadiet (ESRD) kan reagere dårlig på signaler som fremmer disse tilpasningene. Omtrent 20 - 40 % av AVF-modningen mislykkes og ingen effektiv behandling for å forhindre AVF-modningssvikt. Paulson WD oppsummerte fire poeng for modningssvikt. Kirurgisk ferdighet; eksisterende vaskulær sykdom; Oppstrøms hendelser; og nedstrøms arrangementer. Oppstrømshendelser er mekanismene som i utgangspunktet forårsaker skade på endotelet (kirurgisk traume, hemodynamisk skjærspenning, karveggskade forårsaket av nålepunkteringer, etc.). Nedstrøms hendelser er responsene på endotelskade (leukocyttadhesjon, migrering av glatte muskelceller fra media til intimallaget, glattmuskelproliferasjon, etc.). Imidlertid er oppstrøms og nedstrøms hendelser viktige skritt i modningssvikt, eksisterende vaskulær sykdom bør ikke neglisjeres, da den setter scenen for det som følger. Mediale kollagenfibre er organisert i lamellære enheter og orientert perifert med krympninger i friske blodårer. Imidlertid kan høyere medialt kollageninnhold kanskje stivere og begrenset evne til å utvide seg. Nylig har undersøkelser vist at eksisterende fibrosetilstand i vener var assosiert med modning.

Betennelse for AVF-innstilling kan deles inn i to deler: lokal og systemisk inflammasjon. For lokal betennelse hadde blitt indikert forårsaket av traumer ved fisteldannelse og lokal hypoksi; For systemisk betennelse, som oppstår på grunn av uremi hos CKD-pasienter. Nyere studie har antydet at AVF-svikt var knyttet til betennelse. Det perivaskulære fettet i arterien kan forutsies vellykket AVF-modning. Lipektomi av cephalic vene er en rutinemetode under hemodialyse arteriovenøs fisteloppretting[9]. Imidlertid har få tidligere studier sammenlignet AVF-modning mellom perivaskulær fett fra cephalic vene eller fjerning under AVF-operasjonen.

Spesifikke mål

Vellykket fistelmodning avhenger av dilatasjon og ombygging av arterien og venen, men de stive og fortykkede karene til ESRD-pasienter kan reagere dårlig på signaler som fremmer disse tilpasningene. Selv om våre foreløpige data viste at eksisterende vaskulær fibrose økte i AVF-svikt. Men funnet trenger fortsatt flere verifikasjoner. I denne studien vil etterforskerne fokusere på funn av molekylære merker som er relatert til AVFs modning eller svikt. Studien inkluderer følgende seksjoner:

1. Hvorvidt vaskulær fibrose eksisterer hos AVF-pasienter og dens assosiasjon med modningssvikt.
2. Hvorvidt vaskulær fibrose er assosiert med betennelse.
3. Undersøk cytokinekspresjonen av nøytrofil i blod.
4. Hvorvidt det perivaskulære fettet i cephalic vene er assosiert med AVF-svikt

Mål 1. Hvorvidt vaskulær fibrose eksisterer hos AVF-pasienter og dens assosiasjon med modningssvikt. Etterforskere vil observere vaskulær fibrose ved histopatologi og western blot.

For det første er forsøkspersonene de voksne uremiske pasientene som skal gjennomgå en AVF-oppretting. Undersøkelsen vil inkludere pasienter med kronisk nyresykdom (CKD) stadium 5 (CKD-5) og stadium 6 (CKD-6) som vil trenge vedlikeholdshemodialyse (HD). Etterforskere vil bruke det preoperative ultralydvurderingsverktøyet for å bekrefte gjennomførbarheten av armkarene for å lage en naturlig AVF.

Som en prospektiv randomisert kontrollert studie av perivaskulær fettbevaring eller fjerning under AVF-operasjonen, vil en studieassistent hjelpe til med randomiseringen og forklare det informerte samtykket til pasienten. Forsøkspersonene er tilfeldig delt inn i to grupper: Eksperimentgruppen vil ha det perivaskulære fettet fra den cefaliske målvenen bevart. Kontrollgruppen vil få fettet fjernet før AVF anastomosen.

Kirurgen vil høste den distale venestumpen og 1 cm subkutant fett i minst 1,5 cm i lengde under en AVF-oppretting, samtidig vil han få en 10-cc plasmaprøve. Undersøkelsen vil registrere 100 voksne pasienter og kategorisere dem i grupper i henhold til hver AVF-modning, JAS eller FTM (se definisjon nedenfor) innen 3 - 12 etter operasjonen.

Preoperativ vaskulær ultralydvurdering.

Alle pasienter vil ha klinisk undersøkelse og ultralydundersøkelse for å vurdere egnetheten av kirurgi. Pasienten vil bli ekskludert Hvis karene og/eller den kliniske tilstanden deres ikke er egnet for hemodialyse. En hemodialyse arteriovenøs fistel (HDAVF) modenhetspoeng basert på følgende tre objektive ultralydmålinger. Gi et sammendrag fra 0 til 9 poeng. Høyere score indikerer mer moden. Ultralydtestparametere er definert som følger:

1. Måling av armarteriediameter og total blodstrøm. Brachialisarterien er definert som målt fra de proksimale 4 (+/- 2,2 til 6) cm innenfor den buede linjen i albuen. Undersøkere vil måle den vaskulære diameteren og estimere total blodstrøm i underarmen.
2. Radial arterieskanning av underarmen er definert som diameteren til radialarterien skannet fra starten av antecubital til håndleddslinjen. Det skal bemerkes at etterforskere også bekrefter dens diameter > = 2,0 mm og identifiserer ingen åpenbar stenose av antecubital til håndleddet. Det skal bemerkes at etterforskere også bekrefter dens diameter > = 2,0 mm og identifiserer ingen åpenbar stenose.
3. Mål den ikke-forstørrede diameteren til cephalic-venen. Midtpunktet på den er definert som midten mellom albuelinjen og håndleddslinjen, som er rundt 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm distalt til albuen.
4. Mål den utvidede diameteren til cephalic-venen. Trykk påføres overarmen med tourniquet-mansjett til 100 mm Hg midlertidig og som gir moderat motstand, vent 30 sekunder, deretter måler etterforskerne cephalic-venen der det er definert ovenfor. Følgelig er definisjonen av venøs compliance definert som graden av venøs utvidelse av cephalic vene før og etter augmentasjon. Videre er etterlevelsen av vene definert som prosentandelen av utvidet/ikke-forstørret tverrsnittsareal av venen.
5. Etterforskere vil bekrefte at hele segmentet av cephalic vene skal være > 2,0 mm i diameter og identifisere ingen signifikant stenose.

Definisjon av klinisk suksess: Det er definert som målet HDAVF kan brukes av to nåler og fullføre HD-økten i minst ⅔ av forskrivningsøkter i løpet av en måned. Et minimumskriterium for en kjøring er en gjennomsnittlig blodstrømhastighet på 300 ml/min i en 3,5-timers HD-økt for å oppnå en mål-sp-Kt/V på 1.2.14 Der en vellykket HD-sesjon er definert som fullføring av HD med en dialysestrømningshastighet er mer enn 200 ml/min, og en øktvarighet på 4 timer eller mer.

Definisjon av suksess ved ultralydparametere: undersøkelsen foreslår et objektivt ultralydskåringssystem og vurderer en totalscore på fire eller mer som AVF-modning.

For histologisk analyse ble prøver parafininnstøpt og seksjonert. H&E (hematoxylin og eosin) er vanlige flekker som brukes i histologi. Hematoxylin-flekker cellekjernene er blå, og eosin-farger den ekstracellulære matrisen og cytoplasma er rosa. Movat pentakromfarging kan demonstreres at kollagen, elastin, muskelmucin og fibrin i vevsseksjoner. Etterforskere bruker Sirius-rød farging for å observere kollagen I- og III-fibrene i vevssnitt. For å oppdage kalsiumavleiringer bruker etterforskerne Alizan rødfarging. Massons trikrom vil bli brukt til beising. I trikromflekken virker glatt muskulatur rødt, og kollagen ser blått ut.

For western blot-analyse vil kollagen-, α-SMA-, TIMP-1- og TIMP2-ekspresjon øke i vaskulær fibrose. Derfor vil etterforskere oppdage uttrykk av kollagen, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 i AVF-modnings- og sviktvev. Vev ble homogenisert og lysert. Proteinkonsentrasjonen for hvert vevsekstrakt ble bestemt ved å bruke en BCA-proteinanalyse i henhold til instruksjonene fra leverandøren (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Femti mikrogram vevslysatprotein per bane ble separert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser og blottet på PVDF-membraner (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Membraner ble blokkert i 5 % avfettet tørrmelk/PBS/0,1 % Tween-20 (PBST) og ble deretter inkubert med det primære antistoffet i 1 time. Blottene ble vasket 4 ganger PBST, og det sekundære peroksidase-konjugerte antistoffet (Jackson ImmunoResearch Labora-tories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) ble tilsatt (1:10 000) i ytterligere en time. Til slutt ble membraner vasket i PBST, og påvisning av antigenet ble utført ved bruk av den forbedrede kjemiluminescensdeteksjonsmetoden i henhold til produsentens anbefalinger

Mål 2. Om vaskulær fibrose er assosiert med betennelse. Betennelse ved AVF var lokalt og systemisk involvert. Lokal betennelse forårsaket av traumer ved fisteldannelse og lokal hypoksi. Så, etterforskere vil måle IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 og sammenligne uttrykk mellom AVF-modnings- og sviktvev ved QPCR og Multiplex ELISA. Dessuten oppstår systemisk betennelse på grunn av uremi som er tilstede ved kroniske nyresykdommer. Etterforskere vil også oppdage ekspresjon av IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 og sammenligne uttrykk mellom AVF-modnings- og sviktserum ved CBA-analyse.

For QPCR-analyse ble RNA ekstrahert fra venevev ved hjelp av TRIzol-protokollen (Life Technologies, Invitrogen). RNA-konsentrasjoner ble kvantifisert med Nanodrop. Renheten til det totale RNA-ekstrahert ble bestemt som forholdet 260/280 nm, og integriteten ble kontrollert. QPCR ble utført av TaqMan-systemet.

For ELISA-analyse ble vev lysert i PBS-buffer og ved bruk av kommersielle ELISA-sett (R&D) i henhold til produsentens protokoll. Lysatene ble normalisert til det totale proteininnholdet bestemt ved bruk av et kommersielt BCA-proteinanalysesett.

For Cytokine Bead Array (CBA)-analyse ble Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) brukt, som måler alle de ovennevnte cytokinene bortsett fra GM-CSF, IL-2 og IFN-y; data ble innhentet på et BDTM FACS kaliber flowcytometer. Begge analysene ble utført i henhold til produsentens instruksjoner bortsett fra bruken av modifiserte kalibreringskurver som beskrevet nedenfor. Alle standarder og prøver ble målt i duplikat.

Mål 3. Undersøk cytokinekspresjonsprofilen til nøytrofile i blod. For å utføre dette vil etterforskerne undersøke den perifere blodnøytrofilpopulasjonen ved hjelp av flowcytometrifarging med CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Neste for å bestemme prosentandelen av nøytrofiler som uttrykker målcytokiner i perifert blod.