Tulehdusmarkkeri ja olemassa oleva laskimofibroosi ennustavat AVF:n huonon kypsymisen

Valtiolaskimofisteli (AVF) on ensisijainen vaskulaarinen pääsy hemodialyysille, joka luodaan kirurgisesti, mutta joka yhdistää pinnallisen laskimon läheiseen valtimoon ja sallii tämän laskimon laajentua ja sisähalkaisijan kasvaa valtimoverenkierron alaisena. Onnistunut fistelin kypsyminen riippuu valtimon ja laskimon laajentumisesta ja uudelleenmuodostumisesta, mutta loppuvaiheen munuaissairauksien (ESRD) potilaiden jäykät ja paksuuntuneet suonet voivat reagoida huonosti signaaleihin, jotka edistävät näitä mukautumisia. Noin 20–40 % AVF:n kypsymisestä epäonnistuu, eikä tehokasta hoitoa AVF:n kypsymisen estämiseksi ole. Paulson WD tiivisti neljä pistettä kypsymisen epäonnistumisesta. Kirurgiset taidot; olemassa oleva verisuonisairaus; Upstream-tapahtumat; ja loppupään tapahtumia. Ylävirran tapahtumat ovat mekanismeja, jotka aiheuttavat alun perin vaurion endoteelille (kirurginen trauma, hemodynaaminen leikkausjännitys, neulanpistojen aiheuttama verisuonen seinämän vaurio jne.). Alavirran tapahtumat ovat vasteita endoteelivaurioon (leukosyyttien adheesio, sileälihassolujen siirtyminen elatusaineesta sisäkalvoon, sileän lihaksen proliferaatio jne.). Ylävirran ja alavirran tapahtumat ovat kuitenkin tärkeitä vaiheita kypsymisen epäonnistumisessa, eikä olemassa olevaa verisuonisairautta pidä laiminlyödä, koska se luo pohjan seuraavalle. Mediaaliset kollageenisäikeet on organisoitunut lamellaarisiin yksiköihin ja suunnattu kehämäisesti poimuihin terveissä verisuonissa. Kuitenkin korkeampi mediaalinen kollageenipitoisuus saattaa olla jäykempi ja rajoitettu kyky laajentua. Äskettäin tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että suonissa esiintyvä fibroosi on liittynyt kypsymiseen.

AVF-asetuksen tulehdus voidaan jakaa kahteen osaan: paikalliseen ja systeemiseen tulehdukseen. Paikalliseksi tulehdukseksi oli osoitettu fistelin muodostumisen aiheuttama trauma ja paikallinen hypoksia; Systeemiin tulehdukseen, joka johtuu kroonista munuaistautipotilailla esiintyvästä uremiasta. Tuoreen tutkimuksen mukaan AVF:n epäonnistuminen liittyi tulehdukseen. Valtimon perivaskulaarisen rasvan voidaan ennustaa onnistuneen AVF:n kypsymisen. Päälaskimon lipektomia on rutiinimenetelmä hemodialyysin valtimo-laskimofistelin luomisen aikana[9]. Muutamat aiemmat tutkimukset ovat kuitenkin vertailleet AVF:n kypsymistä päälaskimon perivaskulaarisen rasvan tai poiston välillä AVF-leikkauksen aikana.

Erityiset tavoitteet

Onnistunut fistelin kypsyminen riippuu valtimon ja laskimon laajentumisesta ja uudelleenmuodostumisesta, mutta ESRD-potilaiden jäykät ja paksuuntuneet verisuonet voivat reagoida huonosti signaaleihin, jotka edistävät näitä mukautumisia. Vaikka alustavat tietomme osoittivat, että olemassa oleva verisuonifibroosi lisääntyi AVF:n epäonnistumisessa. Mutta löydös vaatii vielä lisätarkastuksia. Tässä tutkimuksessa tutkijat keskittyvät sellaisten molekyylimerkkien löytämiseen, jotka liittyvät AVF:n kypsymiseen tai epäonnistumiseen. Tutkimus sisältää seuraavat osat:

1. Onko AVF-potilailla verisuonifibroosia ja sen yhteys kypsymishäiriöön.
2. Liittyykö verisuonifibroosi tulehdukseen.
3. Tutki neutrofiilien sytokiinien ilmentymistä veressä.
4. Liittyykö päälaskimon perivaskulaarinen rasva AVF:n epäonnistumiseen

Tavoite 1. Onko AVF-potilailla verisuonifibroosia ja sen yhteys kypsymishäiriöön. Tutkijat tarkkailevat verisuonifibroosia histopatologialla ja Western blot -menetelmällä.

Ensinnäkin koehenkilöt ovat aikuisia ureemisia potilaita, joille tehdään AVF:n luominen. Kyselyyn otetaan kroonisen munuaissairauden (CKD) vaiheen 5 (CKD-5) ja vaiheen 6 (CKD-6) potilaat, jotka tarvitsevat ylläpitohemodialyysiä (HD). Tutkijat käyttävät leikkausta edeltävää ultraääniarviointityökalua vahvistaakseen käsivarren verisuonten toteutettavuuden alkuperäisen AVF:n luomiseen.

Prospektiivisena satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksessa perivaskulaarisen rasvan säilyttämisestä tai poistamisesta AVF-leikkauksen aikana, tutkimusavustaja auttaa satunnaistuksessa ja selittää potilaalle tietoisen suostumuksen. Koehenkilöt jaetaan satunnaisesti kahteen ryhmään: koeryhmässä kohdepäälaskimon perivaskulaarinen rasva säilyy, kontrolliryhmästä rasva poistetaan ennen AVF-anastomoosia.

Kirurgi ottaa talteen distaalisen suonen kannon ja 1 cm:n ihonalaista rasvaa vähintään 1,5 cm:n pituudelta AVF:n luomisen aikana, ja samalla hän saa 10 cm3:n plasmanäytteen. Kyselyyn otetaan mukaan 100 aikuista potilasta ja luokitellaan heidät ryhmiin kunkin AVF-kypsymisen, JAS:n tai FTM:n mukaan (katso määritelmä alla) 3–12 klo leikkauksen jälkeen.

Verisuonten ultraäänitutkimus ennen leikkausta.

Kaikille potilaille tehdään kliininen ja ultraäänitutkimus leikkauksen soveltuvuuden arvioimiseksi. Potilas suljetaan pois, jos hänen verisuonensa ja/tai kliininen tilansa eivät sovellu hemodialyysihoitoon. Hemodialyysin arteriovenoosifisteli (HDAVF) kypsyyspisteet, jotka perustuvat seuraaviin kolmeen objektiiviseen ultraäänimittaukseen. Anna yhteenvetopisteiden vaihteluväli 0-9 pistettä. Korkeammat pisteet osoittavat aikuisempaa. Ultraäänitestausparametrit määritellään seuraavasti:

1. Käsivarren valtimon halkaisijan ja kokonaisverenvirtauksen mittaaminen. Olkavarren valtimo määritellään mitattuna proksimaalisesta 4 (+/- 2,2 - 6) cm:stä kyynärpään kaarevasta linjasta. Tutkijat mittaavat verisuonen halkaisijan ja arvioivat kyynärvarren kokonaisverenvirtauksen.
2. Kyynärvarren säteittäinen valtimoskannaus määritellään sen säteittäisen valtimon halkaisijaksi, joka on skannattu kyynärpään alusta ranteen linjaan. Huomattakoon, että tutkijat vahvistavat myös sen halkaisijan > = 2,0 mm eivätkä havaitse mitään ilmeistä antecubitaalin ahtautta ranteeseen. On huomattava, että tutkijat vahvistavat myös sen halkaisijan > = 2,0 mm eivätkä havaitse ilmeistä ahtautta.
3. Mittaa päälaskimon kasvamaton halkaisija. Sen keskipiste määritellään kyynärpäälinjan ja ranteen väliseksi keskipisteeksi, joka on noin 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm etäisyydellä kyynärpäästä.
4. Mittaa päälaskimon laajennettu halkaisija. Paine kohdistetaan olkavarteen kiristysmansetilla tilapäisesti 100 mmHg:iin ja joka tarjoaa kohtalaisen vastuksen, odota 30 sekuntia, sitten tutkijat mittaavat päälaskimon, jossa edellä on määritelty. Näin ollen laskimomyöntyvyyden määritelmä määritellään päälaskimon laskimolaajentumisen asteena ennen augmentaatiota ja sen jälkeen. Lisäksi suonen myöntyvyys määritellään prosenttiosuutena suonen laajennetusta/ei-lisätystä poikkileikkausalasta.
5. Tutkijat vahvistavat, että päälaskimon koko segmentin on oltava halkaisijaltaan > 2,0 mm, eivätkä havaitse merkittävää ahtautta.

Kliinisen menestyksen määritelmä: Se määritellään siten, että HDAVF-kohde voidaan käyttää kahdella neulalla ja suorittaa HD-istunnon vähintään ⅔ reseptijaksoista kuukaudessa. Juoksun vähimmäiskriteeri on keskimääräinen verenvirtausnopeus 300 ml/min 3,5 tunnin HD-istunnon aikana sp-Kt/V-tavoitteen saavuttamiseksi 1,2,14 Jossa onnistunut HD-istunto määritellään HD:n suorittamiseksi dialyysin virtausnopeudella yli 200 ml/min ja istunnon keston vähintään 4 tuntia.

Menestyksen määritelmä ultraääniparametreilla: kyselyssä ehdotetaan objektiivista ultraäänipisteytysjärjestelmää ja AVF:n kypsymisenä pidetään vähintään neljän kokonaispistemäärää.

Histologista analyysiä varten näytteet upotettiin parafiiniin ja leikattiin. H&E (hematoksyliini ja eosiini) ovat yleisiä värjäyksiä, joita käytetään histologiassa. Hematoksyliini värjää soluytimet ovat sinisiä, ja eosiini värjää solunulkoisen matriisin ja sytoplasma on vaaleanpunainen. Movat pentakromivärjäys voidaan osoittaa, että kollageenia, elastiinia, lihasmusiinia ja fibriiniä kudosleikkeissä. Tutkijat käyttävät Sirius-punavärjäystä kollageeni I- ja III-kuitujen tarkkailuun kudosleikkeissä. Kalsiumkertymien havaitsemiseksi tutkijat käyttävät Alizan-punaista värjäystä. Massonin trikromia käytetään värjäykseen. Trichrome-tahrassa sileät lihakset näyttävät punaisilta ja kollageeni siniseltä.

Western blot -määrityksessä kollageenin, α-SMA:n, TIMP-1:n ja TIMP2:n ilmentyminen lisääntyy verisuonifibroosissa. Näin ollen tutkijat havaitsevat kollageenin, α-SMA:n, MMP-9:n, MMP2:n, TIMP-1:n, TIMP2:n ilmentymisen AVF:n kypsymisessä ja vaurioituneessa kudoksessa. Kudokset homogenisoitiin ja lyysattiin. Kunkin kudosuutteen proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimääritystä toimittajan ohjeiden mukaisesti (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Viisikymmentä mikrogrammaa kudoslysaattiproteiinia kaistaa kohden erotettiin SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa ja blotattiin PVDF-kalvoille (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Kalvot blokattiin 5 % rasvattomassa kuivamaito/PBS/0,1 % Tween-20:ssä (PBST) ja inkuboitiin sitten primäärisen vasta-aineen kanssa 1 tunti. Blotit pestiin 4 kertaa PBST:llä ja sekundaarista peroksidaasilla konjugoitua vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) lisättiin (1:10 000) vielä tunnin ajaksi. Lopuksi kalvot pestiin PBST:ssä ja antigeenin havaitseminen suoritettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssitunnistusmenetelmää valmistajan suositusten mukaisesti.

Tavoite 2. Liittyykö verisuonifibroosi tulehdukseen? AVF:n taustalla oleva tulehdus liittyi paikallisesti ja systeemisesti. Paikallinen tulehdus, joka johtuu fistelin muodostumisen traumasta ja paikallisesta hypoksiasta. Joten tutkijat mittaavat IL8:n, IL1b:n, IL6:n, IL10:n, TNF:n, IL12p70:n, CCL5:n (RANTES), CXCL9:n (MIG), CCL2:n (MCP1), IP10:n ja vertaavat ekspressiota AVF:n kypsymisen ja kudosvaurion välillä QPCR:llä ja Multiplex ELISA:lla. Lisäksi systeeminen tulehdus johtuu uremiasta, jota esiintyy kroonisissa munuaissairauksissa. Lisäksi tutkijat havaitsevat IL8:n, IL1b:n, IL6:n, IL10:n, TNF:n, IL12p70:n, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2:n (MCP1), IP10:n ilmentymisen ja vertaavat ilmentymistä AVF:n kypsymisen ja epäonnistuneen seerumin välillä CBA-määrityksellä.

QPCR-määritystä varten RNA uutettiin laskimokudoksesta TRIzol-protokollalla (Life Technologies, Invitrogen). RNA-pitoisuudet kvantifioitiin Nanodropilla. Uutetun kokonais-RNA:n puhtaus määritettiin suhteessa 260/280 nm ja eheys tarkastettiin. QPCR suoritettiin TaqMan-järjestelmällä.

ELISA-määritystä varten kudokset hajotettiin PBS-puskurissa ja käyttämällä kaupallisia ELISA-pakkauksia (R&D) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lysaatit normalisoitiin kokonaisproteiinipitoisuuteen, joka määritettiin käyttämällä kaupallista BCA-proteiinimäärityspakkausta.

Cytokine Bead Array (CBA) -määritykseen käytettiin Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA), joka mittaa kaikkia yllä olevia sytokiineja paitsi GM-CSF:n, IL-2:n ja IFN-y:n; tiedot hankittiin BDTM FACS -kaliiperivirtaussytometrillä. Molemmat määritykset suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti lukuun ottamatta alla kuvattujen modifioitujen kalibrointikäyrien käyttöä. Kaikki standardit ja näytteet mitattiin kahtena rinnakkaisena.

Tavoite 3. Tutki neutrofiilien sytokiinien ilmentymisprofiilia veressä. Tämän suorittamiseksi tutkijat tutkivat perifeerisen veren neutrofiilipopulaatiota virtaussytometrisellä värjäyksellä CD11b+/CD66b/CD34/CD45:llä. Seuraavaksi määritetään kohdesytokiineja ilmentävien neutrofiilien prosenttiosuus ääreisveressä.