Marker zapalny i istniejące wcześniej zwłóknienie żylne w celu przewidywania niedojrzałości AVF

Przetoka tętniczo-żylna (AVF) jest preferowanym dostępem naczyniowym do hemodializy, który jest tworzony chirurgicznie, ale łączy żyłę powierzchowną z pobliską tętnicą i umożliwia tej żyle powiększenie i zwiększenie średnicy wewnętrznej pod wpływem krążenia tętniczego. Pomyślne dojrzewanie przetoki zależy od poszerzenia i przebudowy tętnicy i żyły, ale sztywne i pogrubione naczynia pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek (ESRD) mogą słabo reagować na sygnały promujące te adaptacje. Około 20 - 40% dojrzewania AVF kończy się niepowodzeniem i nie ma skutecznego leczenia zapobiegającego niepowodzeniom dojrzewania AVF. Paulson WD podsumował cztery punkty niepowodzenia dojrzewania. Umiejętności chirurgiczne; istniejąca wcześniej choroba naczyniowa; Wydarzenia poprzedzające; i wydarzenia na dole. Zdarzenia poprzedzające to mechanizmy, które początkowo powodują uszkodzenie śródbłonka (uraz chirurgiczny, hemodynamiczne naprężenie ścinające, uszkodzenie ściany naczynia spowodowane nakłuciem igłą itp.). Zdarzenia w dół to reakcje na uszkodzenie śródbłonka (adhezja leukocytów, migracja komórek mięśni gładkich z błony środkowej do warstwy wewnętrznej, proliferacja mięśni gładkich itp.). Jednak zdarzenia w górę iw dół są ważnymi etapami niepowodzenia dojrzewania, nie należy lekceważyć istniejącej wcześniej choroby naczyniowej, ponieważ przygotowuje ona grunt pod to, co następuje. Przyśrodkowe włókna kolagenowe są zorganizowane w jednostki płytkowe i zorientowane obwodowo z karbami w zdrowych naczyniach krwionośnych. Jednak wyższa zawartość kolagenu w części środkowej może być sztywniejsza i ograniczać zdolność rozszerzania się. Niedawno badania wykazały, że istniejący wcześniej stan zwłóknienia żył był związany z dojrzewaniem.

Zapalenie związane z ustawieniem AVF można podzielić na dwie części: zapalenie miejscowe i ogólnoustrojowe. Wskazano na miejscowy stan zapalny spowodowany urazem powstania przetoki i miejscowym niedotlenieniem; W stanach zapalnych ogólnoustrojowych, które występują z powodu mocznicy występującej u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. Ostatnie badania sugerują, że awaria AVF była związana ze stanem zapalnym. Okołonaczyniowy tłuszcz tętnicy można przewidzieć pomyślne dojrzewanie AVF. Lipektomia żyły odpromieniowej jest rutynową metodą tworzenia przetok tętniczo-żylnych podczas hemodializy[9]. Jednak kilka wcześniejszych badań porównywało dojrzewanie AVF między okołonaczyniowym tłuszczem żyły odpromieniowej a usuwaniem podczas operacji AVF.

Konkretne cele

Pomyślne dojrzewanie przetoki zależy od poszerzenia i przebudowy tętnicy i żyły, ale sztywne i pogrubione naczynia pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek mogą słabo reagować na sygnały promujące te adaptacje. Chociaż nasze wstępne dane wykazały, że istniejące wcześniej zwłóknienie naczyń zwiększyło się w przypadku niepowodzenia AVF. Ale odkrycie wciąż wymaga dalszych weryfikacji. W tym badaniu badacze skupią się na znalezieniu śladów molekularnych związanych z dojrzewaniem lub niepowodzeniem AVF. Badanie obejmuje następujące sekcje:

1. Czy zwłóknienie naczyń występuje u pacjentów z AVF i jego związek z niepowodzeniem dojrzewania.
2. Czy zwłóknienie naczyń jest związane ze stanem zapalnym.
3. Zbadaj ekspresję cytokin neutrofili we krwi.
4. Czy tłuszcz okołonaczyniowy żyły głowowej jest związany z niewydolnością AVF

Cel 1. Czy włóknienie naczyń występuje u pacjentów z AVF i jego związek z niepowodzeniem dojrzewania. Badacze będą obserwować zwłóknienie naczyń za pomocą histopatologii i western blot.

Po pierwsze, podmiotami są ci dorośli pacjenci z mocznicą, którzy zostaną poddani wytworzeniu AVF. Ankieta obejmie pacjentów z przewlekłą chorobą nerek (CKD) w stadium 5 (CKD-5) i w stadium 6 (CKD-6), którzy będą wymagać hemodializy podtrzymującej (HD). Badacze wykorzystają przedoperacyjne narzędzie do oceny ultrasonograficznej, aby potwierdzić wykonalność naczyń ramienia do stworzenia natywnego AVF.

Jako prospektywna, randomizowana, kontrolowana próba zachowania lub usunięcia tłuszczu okołonaczyniowego podczas operacji AVF, asystent badania pomoże w randomizacji i wyjaśni pacjentowi, na czym polega świadoma zgoda. Pacjenci są losowo podzieleni na dwie grupy: w grupie eksperymentalnej zachowany zostanie okołonaczyniowy tłuszcz docelowej żyły odpromieniowej, w grupie kontrolnej zostanie usunięty tłuszcz przed zespoleniem AVF.

Chirurg pobierze dystalny kikut żyły i 1 cm podskórnej tkanki tłuszczowej o długości co najmniej 1,5 cm podczas tworzenia AVF, w tym samym czasie pobierze próbkę osocza o objętości 10 cm3. Ankieta obejmie 100 dorosłych pacjentów i podzieli ich na grupy zgodnie z dojrzewaniem AVF, JAS lub FTM (patrz definicja poniżej) do 3-12 lat po operacji.

Przedoperacyjna ocena ultrasonograficzna naczyń.

Wszyscy pacjenci zostaną poddani badaniu klinicznemu i USG w celu oceny przydatności zabiegu. Pacjent zostanie wykluczony, jeśli jego naczynia i/lub stan kliniczny nie nadają się do hemodializy. Ocena dojrzałości przetoki tętniczo-żylnej do hemodializy (HDAVF) oparta na następujących trzech obiektywnych pomiarach ultradźwiękowych. Podaj sumaryczny zakres punktacji od 0 do 9 punktów. Wyższe wyniki wskazują na bardziej dojrzałe. Parametry badania ultrasonograficznego definiuje się w następujący sposób:

1. Pomiar średnicy tętnicy ramiennej i całkowitego przepływu krwi. Tętnicę ramienną definiuje się jako mierzoną od proksymalnego 4 (+/- 2,2 do 6) cm w obrębie zakrzywionej linii łokcia. Badacze zmierzą średnicę naczynia i oszacują całkowity przepływ krwi w przedramieniu.
2. Skan tętnicy promieniowej przedramienia definiuje się jako średnicę tętnicy promieniowej skanowaną od początku łokcia do linii nadgarstka. Warto zauważyć, że badacze potwierdzili również jego średnicę> = 2,0 mm i nie stwierdzili wyraźnego zwężenia kości przedłokciowej do linii nadgarstka. Warto zauważyć, że badacze potwierdzili również jego średnicę> = 2,0 mm i nie stwierdzili wyraźnego zwężenia.
3. Zmierzyć niepowiększoną średnicę żyły odpromieniowej. Jego środek jest zdefiniowany jako środek między linią łokcia a linią nadgarstka, czyli około 10 (+/- 2, 8 ~ 12) cm dystalnie od łokcia.
4. Zmierzyć powiększoną średnicę żyły odpromieniowej. Ciśnienie przykłada się do ramienia za pomocą opaski uciskowej tymczasowo do 100 mm Hg, co zapewnia umiarkowany opór, odczekaj 30 sekund, następnie badacze mierzą żyłę głowową w miejscu określonym powyżej. W związku z tym definicja podatności żylnej jest zdefiniowana jako stopień poszerzenia żylnego żyły odpromieniowej przed i po zabiegu augmentacji. Ponadto podatność żyły definiuje się jako procent powiększonej/niepowiększonej powierzchni przekroju żyły.
5. Badacze potwierdzą, że cały odcinek żyły odpromieniowej ma średnicę > 2,0 mm i nie stwierdzi istotnego zwężenia.

Definicja sukcesu klinicznego: Definiuje się, że docelowy HDAVF może być użyty przez dwie igły i ukończyć sesję HD przez co najmniej ⅔ zalecanych sesji w miesiącu. Minimalnym kryterium biegu jest średni przepływ krwi wynoszący 300 ml/min podczas 3,5-godzinnej sesji HD w celu osiągnięcia docelowej wartości sp-Kt/V wynoszącej 1,2,14 W której udaną sesję HD definiuje się jako ukończenie HD z szybkością przepływu dializy większą niż 200 ml/min i czasem trwania sesji wynoszącym 4 godziny lub więcej.

Definicja sukcesu na podstawie parametrów ultrasonograficznych: ankieta proponuje obiektywny system punktacji ultrasonograficznej i uważa, że ​​całkowity wynik wynoszący cztery lub więcej oznacza dojrzewanie AVF.

Do analizy histologicznej próbki zatopiono w parafinie i podzielono na skrawki. H&E (hematoksylina i eozyna) to powszechnie stosowane barwniki w histologii. Hematoksylina zabarwia jądra komórkowe na kolor niebieski, a eozyna zabarwia macierz pozakomórkową, a cytoplazma jest różowa. Za pomocą barwienia pentachromem Movat można wykazać obecność kolagenu, elastyny, mucyny mięśniowej i fibryny w skrawkach tkanek. Badacze stosują barwienie czerwienią Syriusza do obserwacji włókien kolagenu I i III w skrawkach tkanek. W celu wykrycia złogów wapnia badacze stosują barwienie czerwienią Alizan. Trichrome Massona zostaną użyte do barwienia. W barwieniu trichromowym mięśnie gładkie są czerwone, a kolagen niebieski.

W teście Western blot ekspresja kolagenu, α-SMA, TIMP-1 i TIMP2 wzrośnie we zwłóknieniu naczyń. W związku z tym badacze wykryją ekspresję kolagenu, α-SMA, MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP2 w dojrzewającej i uszkodzonej tkance AVF. Tkanki homogenizowano i poddawano lizie. Stężenie białka dla każdego ekstraktu tkankowego określono za pomocą testu białkowego BCA zgodnie z instrukcjami dostawcy (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Pięćdziesiąt mikrogramów białek lizatów tkankowych na ścieżkę rozdzielono metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących i przeniesiono na membrany PVDF (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Błony blokowano w 5% odtłuszczonym mleku w proszku/PBS/0,1% Tween-20 (PBST), a następnie inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem przez 1 godzinę. Bloty przemyto 4 razy PBST i dodano drugorzędowe przeciwciało skoniugowane z peroksydazą (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pensylwania, USA) (1:10 000) na kolejną godzinę. Na koniec membrany przemyto PBST i przeprowadzono detekcję antygenu metodą detekcji wzmocnionej chemiluminescencji zgodnie z zaleceniami producenta

Cel 2. Czy włóknienie naczyń wiąże się ze stanem zapalnym. Zapalenie w przebiegu AVF dotyczyło miejscowo i układowo. Miejscowy stan zapalny spowodowany urazem powstania przetoki i miejscowym niedotlenieniem. Tak więc badacze będą mierzyć IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 i porównywać ekspresję między dojrzewaniem AVF a tkanką niepowodzeniem za pomocą QPCR i multipleksowego testu ELISA. Poza tym ogólnoustrojowe zapalenie występuje z powodu mocznicy, która występuje w przewlekłych chorobach nerek. Badacze wykryją również ekspresję IL8, IL1b, IL6, IL10, TNF, IL12p70, CCL5(RANTES), CXCL9 (MIG), CCL2 (MCP1), IP10 i porównają ekspresję między surowicą dojrzewania AVF a surowicą niepowodzenia za pomocą testu CBA.

Do testu QPCR RNA ekstrahowano z tkanki żyły za pomocą protokołu TRIzol (Life Technologies, Invitrogen). Stężenia RNA określono ilościowo za pomocą Nanodrop. Czystość całkowitego wyekstrahowanego RNA określono jako stosunek 260/280 nm i sprawdzono integralność. QPCR przeprowadzono za pomocą systemu TaqMan.

W teście ELISA tkanki poddano lizie w buforze PBS i przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA (R&D) zgodnie z protokołem producenta. Lizaty normalizowano do całkowitej zawartości białka określonej przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białek BCA.

Do testu Cytokine Bead Array (CBA) zastosowano zestaw Human Inflammatory Cytokines CBA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA), który mierzy wszystkie powyższe cytokiny z wyjątkiem GM-CSF, IL-2 i IFN-γ; dane uzyskano na cytometrze przepływowym kalibru BDTM FACS. Oba testy przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem zastosowania zmodyfikowanych krzywych kalibracyjnych, jak opisano poniżej. Wszystkie standardy i próbki mierzono w dwóch powtórzeniach.

Cel 3. Zbadanie profilu ekspresji cytokin neutrofili we krwi. W tym celu badacze zbadają populację neutrofilów we krwi obwodowej za pomocą barwienia metodą cytometrii przepływowej CD11b+/CD66b/CD34/CD45. Następnie określenie odsetka neutrofilów wykazujących ekspresję docelowych cytokin we krwi obwodowej.