パーキンソン病における末梢免疫に対するプロバイオティクスの影響

はじめに パーキンソン病 (PD) は一般的な神経変性疾患であり、常に 1000 人に 1 ～ 2 人が罹患しています。 有病率は年齢とともに増加し、65歳以上では1%と推定されています。

PDの発症を予防したり進行を遅らせたりする治療法はなく、治療は症状の管理に重点が置かれています。 カルビドパ/レボドパの投与により運動症状の制御が可能になりますが、病気が進行するにつれて効果が薄れ、1日の用量を増やすとより頻繁で重篤な副作用が発生します。

PD の組織病理学的特徴は、ドーパミン作動性ニューロンの喪失と、生き残ったニューロンにおける α-シヌクレイン (α-syn) の蓄積ですが、根底にある病態生理学はまだ不明です。 有害な免疫機能と防御的な免疫機能の間の不均衡、および活性酸素種（ROS）によって引き起こされる神経毒性により、炎症機構がこの疾患において重要な役割を果たしていることが示唆されています。

さらなる証拠は、PDにおける末梢適応免疫の関与を強調しており、PD患者におけるT細胞部分集団およびCD4+ T細胞における転写因子の発現の不均衡を報告している。

これらの患者では、臨床的に確立された疾患の発症に先立ち、非運動症状が現れる可能性があります。

PD の病因はまだ不明ですが、Braak らによる独創的な研究が発表されました。は、α-syn が腸内で最初に凝集し、その後迷走神経に沿って脳に伝播し、最終的に中脳の黒質に到達すると仮説を立てました。

興味深いことに、α-synを過剰発現するPDのマウスモデルでは、腸内微生物叢の欠如によりミクログリアの活性化と運動障害の両方が防止され、PDの病因と発症における腸と微生物叢の基本的な役割が示唆された。

最近の論文では、Magistrelli et al.プロバイオティクスが末梢免疫系に影響を与える可能性があることを確認しました。 特に、PD患者コホートの末梢血単核球（PMBC）において、プロバイオティクスは抗炎症プロファイルに向けてサイトカインの産生を調節し、活性酸素種（ROS）の産生を減少させることができた。 プロバイオティクスの臨床効果は、他の病理学的状態でも研究されています。 タンコウら。 9人の多発性硬化症患者のコホートにVSL#3を投与したところ、末梢免疫系が抗炎症プロファイルに移行し、VSL#3中止後は逆の傾向が見られた。 これらの結果は、プロバイオティクスの混合物（乳酸菌4株とビフィズス菌3株）を投与した後の同じグループによっても確認されました。

この証拠に照らして、研究者らは、プロバイオティクスがPD患者コホートの末梢免疫系に影響を与えることができるかどうかを試験することを主な目的とするランダム化対照臨床試験を設計した。 このプロトコルの目的は、転写因子メッセンジャーのリボ核酸 (mRNA) レベル、リンパ球亜集団 (Th1、Th2、Th17、Treg)、サイトカイン レベル、ROS 産生の変化を強調することです。

方法と分析 この探索的研究は、パーキンソン病患者の末梢免疫系の調節におけるプロバイオティクスの有効性を評価するためのランダム化プラセボ対照二重盲検研究です。 参加者は2つの比較可能なグループに無作為に割り付けられ、プロバイオティクスまたは対応するプラセボの混合物で1日1回、3か月間治療される。 この研究の主な目的は、末梢免疫系に対するプロバイオティクスの効果を検証することです。 探索的結果として、PD の運動症状と非運動症状、および 3 か月の治療期間にわたる認知機能と生活の質が、選択された臨床評価スケールを介してモニターされます。

参加者の特定 被験者は、Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara で定期的なフォローアップ訪問が予定されている患者の中から募集されます。 これらの対象者の併存疾患、現在の治療法、人口統計データに関する詳細情報はすぐに入手できます。 試験計画の概要が簡単に説明され、患者は参加への関心を尋ねられます。 希望する被験者はスクリーニング訪問に参加し、適格性を確認する前に書面によるインフォームドコンセントが得られます。

裁判手続き

臨床 登録訪問中に、医学的および神経学的検査により、各参加者に対する薬物療法の即時の変更の必要性が評価されます。 2 週間以内に治療の変更が完了し、ベースライン訪問の予定が立てられます。

ベースライン訪問（T0）中に、対象の状態と対象基準の持続性を確認するために身体検査と神経学的検査が繰り返され、ベースライン採血が実行され、ベースラインスコアを設定するためにすべての臨床評価スケールが完了します。 各参加者は、適切なインフォームドコンセントへの加入後、無作為に割り付けられ、割り当てられた製剤の粉末 2.7 g が入った単回用量の小袋が入った治療箱を与えられます。 患者には、毎朝朝食前に自宅で1日分を摂取し、1袋の内容物を約125mlの真水または他の冷たい非炭酸飲料に混ぜるよう指示されます。 参加者は、回収とコンプライアンス評価のために、未使用または空のパッケージを保管するよう指示されます。

フォローアップ訪問は、T0 の 4 週間後 (T1) と T0 の 12 週間後 (T2) に予定されます。 T1 では、身体検査と神経学的検査が繰り返され、すべての臨床スケールが再度実施されます。 T2 では、採血を含め、T0 で実行されたすべての評価が再度実行されます。

Ｔ０およびＴ２において、４０ｍｌの静脈血の採取を、絶食夜の後の午前８時から１０時の間に、エチレンジアミン四酢酸でコーティングされたチューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）内で実施する。 チューブはコード化され、処理まで 24 時間以内に室温で保管されます。 分別分析を伴う全血球計算は、別々の血液サンプルに対して実行されます。

実験方法

サイトカイン測定 プロバイオティクス治療が炎症プロファイルに及ぼす影響の可能性は、T0 および T2 でプロバイオティクスの血漿レベル（例：サイトカイン）を測定することによって評価されます。 腫瘍壊死因子 (TNF)-α、インターフェロン (IFN)-γ) および抗炎症性サイトカイン (インターロイキン (IL)-10、IL-4)。 すべてのサンプルからの血漿アリコートは、サイトカインアッセイのために分離および保管されます。 2 mL の新鮮な血液を室温で 1400 g で 10 分間遠心分離し、サイトカイン レベルをアッセイするために 350 μL の 2 つの血漿アリコートを 1.5 mL バイアルに保存します。

免疫表現型のフローサイトメトリーによる評価 免疫表現型の変化の可能性を調査するために、Kustrimovic et al. が記載した戦略に従って、細胞蛍光分析による評価によって、自然免疫と適応免疫の両方のプロファイルを深めます。 2018年には、特に自然免疫に特化したパネルを追加しました。 適応免疫系の次の細胞サブセットが評価されます: CD4+ および CD8+ T ナイーブ/メモリー細胞、CD4+ T ヘルパー サブセット、CD4+ 制御性 T 細胞。 さらに、自然免疫については、単球とナチュラルキラー (NK) 細胞も評価されます。 取得は、BD FACS Diva ソフトウェア (バージョン 8.0.1.1) を備えた BD 蛍光活性化セルソーティング (FACS) Celesta フローサイトメーター (Becton Dickinson Italy、ミラノ、イタリア) で実行されます。 データは FlowJo ソフトウェア (バージョン 10.7.1) で分析されます。

転写因子の mRNA 評価 Kustrimovic と De Francesco による以前の研究によれば、CD4+ T リンパ球における主要な転写因子の mRNA レベルを変化させるプロバイオティクス治療の能力も調査される予定です。 CD4+ 陽性細胞は PBMC によって取得され、Ficoll-Paque Plus 密度勾配遠心分離を使用して全血から分離されます。 再懸濁後、10 mL の溶解バッファー ((g/L) NH4Cl 8.248、KHCO3 1.0、EDTA 0.0368) を添加して、残留汚染赤血球を溶解します。 細胞を精製ウシ血清（PBS）で 10 mL の PBS を加えて 2 回洗浄し、室温で 300 g で 10 分間遠心分離し、10 mL のロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）/10% ウシ胎児培地に再懸濁します。血清（FBS）。 次に、手動細胞計数を実行して、CD4 分離試薬の量を設定します。

典型的な PBMC 調製物には、少なくとも 80% のリンパ球が含まれます。 その後、Dynabeads CD4 Positive Isolation キットを使用して CD4+ T 細胞を PBMC から単離します。 次に、少なくとも 50,000 個の分離された CD4+ T 細胞が PerfectPure RNA 溶解バッファー (5 Prime GmbH、ハンブルク、ドイツ) に再懸濁され、PerfectPure RNA Cell Kit™ によって全 RNA が抽出されます。

逆転写は、ランダムプライマーと大容量の相補的 DNA (cDNA) リアルタイム (RT) キットを使用して、得られた mRNA に対して実行されます。

RT ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は 1 μM cDNA を使用して実行されます。 cDNA の増幅により、転写因子遺伝子 TBX21、STAT1、STAT3、STAT4、STAT6、RORC、GATA3、FOXP3、および NR4A2 の mRNA レベルの分析が可能になります。

治療の構成と理論的根拠

処理：

ビフィズス菌アニマリス亜種 ラクティス BS01 ≥ 1 x 10^9 コロニー形成単位 (CFU) ビフィドバクテリウム ロンガム 03 ≥ 1 x 10^9 CFU ビフィドバクテリウム アドルセンティス BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU フラクトオリゴ糖 FOS 2500 mg マルトデキストリン q.s.

プラセボ：

マルトデキストリン適量

各プロバイオティクス製剤には、ビフィドバクテリウム アニマリス亜種が含まれています。 ラクティス（BS01）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（BL03）、ビフィドバクテリウム・アドルセンティス（BA02）。 フラクトオリゴ糖 (FOS) がプレバイオティカル成分として添加され、マルトデキストリンが増量剤として使用されます。

この研究のためのプロバイオティクスの選択は、確かな文献データ、特にビフィドバクテリウム・アニマリス亜種で治療されたPD患者のPBMCに基づいています。 ラクティス (BS01) は、抗炎症性サイトカイン IL-10 の産生の増加を示しました。 前記処理は、CacO2細胞モデルにおける膜の完全性の回復もサポートした。

使用されるすべてのプロバイオティクスは、「欧州食品安全機関 (EFSA) に通知された、食品または飼料に意図的に添加される適格安全性推定 (QPS) 推奨の生物製剤 12」に含まれています。

プラセボ製剤はマルトデキストリンのみで構成されています。

サンプルサイズの計算、データ分析 この研究のデザインは探索的であり、プロバイオティクスまたはプラセボによる治療に同様にランダム化されています。 提案された研究は探索的な性質を持っているため、正式なサンプル サイズの計算は厳密には必要ありません。 したがって、この研究のサンプルサイズは、主に別の in vitro 研究の以前の結果に基づいており、試験したすべてのプロバイオティクス株について 40 人の PD 患者の小さなコホートにおいて統計的に有意な結果が得られ、炎症誘発性サイトカインの産生が全体的に減少し、炎症誘発性サイトカインの産生が増加しました。抗炎症性サイトカイン。 現在の研究では、予想されるサンプルは 2 倍になり、T0 と T2 の両方で合計 80 個の標本が収集されます。

以前の in vitro 研究のデータは、試験されたすべてのプロバイオティクス菌株の in vitro 効果について方向性サンプル サイズを推定するために使用されており、サンプル サイズ 80 人の被験者により、試験されたほとんどのサイトカインの変動を 80% を超える期待検出力で決定できます。統計的有意性の閾値は 0.05 です。

収集されたデータの統計分析は、データ分布の正規性を評価し、独立変数の比較に必要に応じて両側スチューデント t 検定またはマン-ホイットニー検定を使用した後に実行されます。 データの相関関係は、ピアソンまたはスピアマンの相関テストを通じて分析されます。 3 つ以上のグループ間の比較には ANOVA またはクラスカル-ウォリス検定が使用され、対応のあるグループを比較する場合には対応のある t 検定またはウィルコクソンの符号付き順位検定が使用されます (例: ベースラインと治療終了、治療とプラセボ）。 統計的有意性のしきい値は、特定のテストの特性に従って設定されます。