Effets des probiotiques sur l'immunité périphérique dans la maladie de Parkinson

Introduction La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative courante, affectant jusqu'à 1 à 2 personnes sur 1000 à un moment donné. La prévalence augmente avec l'âge et est estimée à 1 % chez les personnes de plus de 65 ans.

Il n'existe aucun traitement disponible pour prévenir l'apparition de la MP ou pour retarder sa progression et le traitement est axé sur la gestion des symptômes. L'administration de carbidopa/lévodopa permet de contrôler les symptômes moteurs, mais elle devient moins efficace au fur et à mesure que la maladie progresse et l'augmentation des doses quotidiennes entraîne des effets secondaires plus fréquents et plus graves.

La caractéristique histopathologique de la MP est la perte de neurones dopaminergiques et l'accumulation d'α-synucléine (α-syn) dans les neurones survivants, mais la physiopathologie sous-jacente n'est toujours pas claire. Il a été suggéré que les mécanismes inflammatoires jouent un rôle de premier plan dans la maladie, avec un déséquilibre entre les fonctions immunitaires nuisibles et protectrices, ainsi qu'une neurotoxicité causée par les espèces réactives de l'oxygène (ROS).

D'autres preuves mettent en évidence l'implication de l'immunité adaptative périphérique dans la MP, signalant un déséquilibre dans les sous-populations de cellules T et dans l'expression des facteurs transcriptionnels dans les cellules T CD4 + chez les patients atteints de MP.

Chez ces patients, des symptômes non moteurs peuvent précéder l'apparition d'une maladie cliniquement établie.

L'étiopathogénie de la MP est encore inconnue, mais les travaux précurseurs de Braak et al. ont émis l'hypothèse d'une agrégation initiale de α-syn dans l'intestin avec propagation ultérieure le long du nerf vague jusqu'au cerveau, atteignant finalement la substantia nigra dans le mésencéphale.

Fait intéressant, dans un modèle murin de MP surexprimant α-syn, l'absence de microbiote intestinal a empêché à la fois l'activation de la microglie et la déficience motrice, indiquant ainsi un rôle fondamental de l'intestin et du microbiote dans la pathogenèse et le développement de la MP.

Dans un article récent, Magistrelli et al. confirmé que les probiotiques peuvent influencer le système immunitaire périphérique. En particulier, dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PMBC) d'une cohorte de patients atteints de MP, les probiotiques ont pu moduler la production de cytokines vers un profil anti-inflammatoire et réduire la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Les effets cliniques des probiotiques ont également été explorés dans d'autres conditions pathologiques. Tankou et al. administré VSL#3 dans une cohorte de 9 patients atteints de sclérose en plaques, dont le système immunitaire périphérique s'est déplacé vers un profil anti-inflammatoire, avec une tendance inverse après l'arrêt de VSL#3. Ces résultats ont également été confirmés par le même groupe après administration d'un mélange de probiotiques (quatre souches de Lactobacillus et trois souches de Bifidobacterium).

À la lumière de ces preuves, les chercheurs ont conçu un essai clinique contrôlé randomisé dont l'objectif principal est de tester si les probiotiques peuvent influencer le système immunitaire périphérique dans une cohorte de patients parkinsoniens. L'objectif du protocole est de mettre en évidence les changements dans les niveaux d'acide ribonucléique messager (ARNm) des facteurs de transcription, les sous-populations de lymphocytes (Th1, Th2, Th17 et Treg), les niveaux de cytokines et la production de ROS.

Méthodes et analyses Cette étude exploratoire est une étude randomisée contrôlée contre placebo en double aveugle pour évaluer l'efficacité des probiotiques dans la modulation du système immunitaire périphérique chez des sujets atteints de la maladie de Parkinson. Les participants seront randomisés en deux groupes comparables et traités avec un mélange de probiotiques ou un placebo correspondant une fois par jour pendant trois mois. L'objectif principal de cette étude est de vérifier les effets des probiotiques sur le système immunitaire périphérique. En tant que résultats exploratoires, les symptômes moteurs et non moteurs de la MP seront surveillés, ainsi que la fonction cognitive et la qualité de vie au cours de la période de traitement de trois mois via une sélection d'échelles d'évaluation clinique.

Identification des participants Les sujets seront recrutés parmi les patients ayant des visites de suivi de routine programmées à l'Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Des informations détaillées sur les comorbidités, le traitement médical actuel et les données démographiques de ces sujets seront facilement disponibles. La conception de l'essai sera brièvement décrite et les patients seront interrogés sur leur intérêt à participer. Les sujets volontaires assisteront à une visite de sélection, un consentement éclairé écrit sera obtenu avant de confirmer leur éligibilité.

Procédures d'essai

Clinique Lors de la visite d'inscription, un examen médical et neurologique évaluera la nécessité de variations immédiates du traitement médical pour chaque participant. Dans les deux semaines, toute modification de traitement sera terminée et une visite de référence sera programmée.

Au cours de la visite de référence (T0), les examens physiques et neurologiques seront répétés pour confirmer les conditions du sujet et la persistance des critères d'inclusion, un prélèvement sanguin de référence sera effectué et toutes les échelles d'évaluation clinique seront complétées pour définir les scores de référence. Chaque participant, après la souscription d'un consentement éclairé approprié, sera randomisé et recevra une boîte de traitement, contenant des sachets unidoses avec 2,7 g de poudre de la formulation attribuée. Les patients seront invités à prendre des doses quotidiennes à domicile tous les matins avant le petit-déjeuner, en mélangeant le contenu d'un sachet dans environ 125 ml d'eau fraîche ou d'une autre boisson froide non gazeuse. Les participants seront invités à conserver les emballages inutilisés ou vides pour le rappel et l'évaluation de la conformité.

Des visites de suivi seront programmées à 4 semaines après T0 (T1) et à 12 semaines après T0 (T2). Au T1, l'examen physique et neurologique sera répété et toutes les échelles cliniques administrées à nouveau. A T2, toutes les évaluations réalisées à T0 seront à nouveau réalisées, y compris les prélèvements sanguins.

A T0 et T2, un prélèvement de 40 ml de sang veineux sera effectué après une nuit à jeun, entre 8h00 et 10h00, dans des tubes revêtus d'acide éthylènediaminetétraacétique (BD Vacutainer). Les tubes seront codés et conservés à température ambiante jusqu'au traitement, dans les 24 heures. Une numération globulaire complète avec analyse différentielle sera effectuée sur des échantillons de sang distincts.

Méthodes de laboratoire

Dosage des cytokines L'influence éventuelle d'un traitement probiotique sur le profil inflammatoire sera évaluée en mesurant à T0 et T2 les taux plasmatiques de pro (ex. Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, Interféron (IFN)-γ) et des cytokines anti-inflammatoires (Interleukine (IL)-10, IL-4). Des aliquotes de plasma de chaque échantillon seront séparées et stockées pour les dosages de cytokines. 2 mL de sang frais seront centrifugés à 1400g pendant 10 minutes à température ambiante et deux aliquotes de plasma de 350 µL chacune seront stockées dans des flacons de 1,5mL pour doser les niveaux de cytokines.

Évaluation par cytométrie en flux du phénotype immunitaire Afin d'étudier d'éventuelles modifications du phénotype immunitaire, le profil de l'immunité innée et adaptative sera approfondi au moyen d'une évaluation cytofluorimétrique selon la stratégie décrite par Kustrimovic et al. en 2018 et avec des panels supplémentaires spécifiquement dédiés à l'immunité innée. Les sous-ensembles cellulaires suivants du système immunitaire adaptatif seront évalués : les cellules CD4+ et CD8+ T naïves/mémoire, les sous-ensembles CD4+ T helper et les lymphocytes T régulateurs CD4+. De plus, pour l'immunité innée, les monocytes et les cellules Natural Killer (NK) seront également évalués. L'acquisition sera effectuée sur un cytomètre en flux Celesta de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) BD (Becton Dickinson Italie, Milan, Italie) avec le logiciel BD FACS Diva (version 8.0.1.1) et les données seront analysées avec le logiciel FlowJo (version 10.7.1)

Évaluation de l'ARNm des facteurs transcriptionnels Selon des études antérieures de Kustrimovic et De Francesco, la capacité d'un traitement probiotique à modifier les niveaux d'ARNm des principaux facteurs transcriptionnels dans les lymphocytes T CD4+ sera également étudiée. Les cellules CD4+ positives seront obtenues par PBMC, qui seront isolées du sang total par centrifugation en gradient de densité Ficoll-Paque Plus. Après remise en suspension, les érythrocytes contaminants résiduels seront lysés par addition de 10 mL de tampon de lyse ((g/L) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368). Les cellules seront lavées deux fois dans du Purified Bovine Serum (PBS) par addition de 10 mL de PBS, puis centrifugées à 300 g pendant 10 min à température ambiante et remises en suspension dans 10 mL de Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)/10% Fetal Bovine Sérum (FBS). Un comptage manuel des cellules sera ensuite effectué pour définir les quantités de réactifs de séparation CD4.

Les préparations typiques de PBMC contiendront au moins 80 % de lymphocytes. Les lymphocytes T CD4+ seront ensuite isolés des PBMC au moyen du kit Dynabeads CD4 Positive Isolation. Au moins 50 000 lymphocytes T CD4+ séparés seront ensuite remis en suspension dans un tampon de lyse d'ARN PerfectPure (5 Prime GmbH, Hambourg, Allemagne), et l'ARN total sera extrait par PerfectPure RNA Cell Kit™.

La transcription inverse sera effectuée sur l'ARNm résultant à l'aide d'une amorce aléatoire et d'un kit en temps réel (RT) d'ADN complémentaire (ADNc) à haute capacité.

Des réactions en chaîne par RT-polymérase (PCR) seront réalisées avec 1 μM d'ADNc. L'amplification de l'ADNc permettra l'analyse des niveaux d'ARNm des gènes des facteurs de transcription TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 et NR4A2.

Composition et justification du traitement

Traitement:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Unités Formant Colonies (UFC) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 UFC Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 UFC Fructo-oligosaccharides FOS 2500 mg Maltodextrine q.s.

Placebo:

Maltodextrine q.s.

Chaque formulation de probiotiques contient Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) et Bifidobacterium adolescentis (BA02). Des fructo-oligosaccharides (FOS) sont ajoutés comme composant prébiotique et la maltodextrine est utilisée comme agent de charge.

Le choix des probiotiques pour cette étude est basé sur de solides données de la littérature : en particulier les PBMC de patients parkinsoniens traités avec Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) a montré une production accrue de cytokine anti-inflammatoire IL-10. Ledit traitement a également soutenu la restauration de l'intégrité de la membrane dans un modèle de cellules CacO2.

Tous les probiotiques utilisés sont inclus dans la "présomption qualifiée de sécurité (QPS) - agents biologiques recommandés ajoutés intentionnellement aux denrées alimentaires ou aux aliments pour animaux, tels que notifiés à l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) 12".

La formulation placebo est uniquement composée de maltodextrine.

Calcul de la taille de l'échantillon, analyse des données La conception de cette étude est exploratoire et également randomisée pour un traitement avec des probiotiques ou un placebo. En raison de la nature exploratoire de l'étude proposée, un calcul formel de la taille de l'échantillon n'est pas strictement requis. La taille de l'échantillon pour cette étude a donc été basée principalement sur les résultats antérieurs d'une autre étude in vitro, qui a donné des résultats statistiquement significatifs dans une petite cohorte de 40 patients parkinsoniens pour toutes les souches probiotiques testées, avec une réduction globale de la production de cytokines pro-inflammatoires et une augmentation de la cytokines anti-inflammatoires. Dans la présente étude, l'échantillon attendu sera doublé, avec un total de 80 spécimens à collecter à la fois à T0 et à T2.

Les données d'une précédente étude in vitro ont été utilisées pour estimer la taille des échantillons d'orientation pour l'effet in vitro de toutes les souches probiotiques testées et une taille d'échantillon de 80 sujets permet de déterminer la plupart des variations de cytokines testées avec une puissance attendue supérieure à 80%, réglage le seuil de signification statistique à 0,05.

L'analyse statistique des données collectées sera effectuée après avoir évalué la normalité de la distribution des données et utilisé le test t de Student bilatéral ou le test de Mann-Whitney, selon le cas, pour les comparaisons de variables indépendantes. Les corrélations de données seront analysées à l'aide des tests de corrélation de Pearson ou de Spearman. L'ANOVA ou les tests de Kruskal-Wallis seront utilisés pour les comparaisons entre plus de deux groupes et le test t apparié ou le test des rangs signés de Wilcoxon seront utilisés lors de la comparaison de groupes appariés (par ex. départ vs fin de traitement, traitement vs placebo). Les seuils de signification statistique seront fixés en fonction des caractéristiques spécifiques du test.